MSTN基因編輯牛的鑒定及基因分型新方法

蘇秋菊 周翔 李光鵬 白春玲 許文濤 劉榜

（1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；2. 內(nèi)蒙古大學(xué)省部共建草原家畜生殖調(diào)控與繁育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010070；3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

基因編輯技術(shù)是通過(guò)對(duì)目的基因進(jìn)行編輯，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組精確修飾的一種嶄新方法。目前常用的基因編輯方法主要有：鋅指核酸酶（Zincfinger nucleases，ZFNs）［1］、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸 酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALEN）［2］和成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/ CRISPR相關(guān)蛋白9（CRISPR associated protein 9，Cas9）［3］，近年來(lái)由于 CRISPR/Cas9 具有高效性、易操作、低成本、周期短等優(yōu)點(diǎn)［4］，在動(dòng)植物的基因修飾中深受青睞。

在動(dòng)物中，通過(guò)對(duì)不利基因編輯使其功能喪失來(lái)進(jìn)行動(dòng)物的改良。Myostation（MSTN）基因編碼的肌肉生長(zhǎng)抑制素是一種肌肉生長(zhǎng)負(fù)調(diào)節(jié)因子［5-6］，動(dòng)物體內(nèi)缺失或失活可能導(dǎo)致肌肉細(xì)胞數(shù)量增加，肌纖維直徑增大，肌纖維數(shù)量增加，肌肉過(guò)度發(fā)育，但對(duì)動(dòng)物的生存無(wú)影響［7］。自然突變或基因編輯都可能導(dǎo)致MSTN發(fā)生功能性失活，而表現(xiàn)“雙肌”現(xiàn)象。Hanset等發(fā)現(xiàn)自然突變引起“雙肌”的比利時(shí)藍(lán)牛比普通牛的肌纖維數(shù)量更多［8］。近年來(lái)內(nèi)蒙古大學(xué)以牛為研究對(duì)象成功進(jìn)行MSTN的編輯使其缺失了6 bp，其中4 bp在第一外顯子上，因而形成移碼突變，不能產(chǎn)生正常的蛋白質(zhì)而喪失功能，使編輯牛的產(chǎn)肉量和生長(zhǎng)速度得到顯著提高。

目前用于基因編輯檢測(cè)方法主要有：PCR-限制性核酸內(nèi)切酶（PCR-restriction enzyme，PCRRE），T7 核酸內(nèi)切酶 I（T7 endonuclease I，T7EI），Surveyor核酸酶和高分辨率熔解曲線（High-resolution melting，HRM）分析等。PCR-RE法是根據(jù)限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的變化，對(duì)突變體進(jìn)行鑒定以及基因分型的方法［9］；T7EI和Surveyor核酸酶是一種非配對(duì)內(nèi)切酶，通過(guò)識(shí)別并切割異源雙鏈DNA，產(chǎn)生兩個(gè)或更多個(gè)較小的片段，從而達(dá)到對(duì)突變體進(jìn)行鑒定的目的［10］；HRM分析法是利用與熒光染料結(jié)合的雙鏈DNA在溫度升高過(guò)程中會(huì)發(fā)生減色效應(yīng)的物理性質(zhì)，通過(guò)檢測(cè)雙鏈DNA在溶解過(guò)程中釋放的染料熒光信號(hào)所形成的特征溶解曲線進(jìn)行基因分型［11］。雖然這些方法可以成功地用于突變體的篩選或基因分型，但是也存在一定的局限性，諸如需要限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，酶切不完全，成本較高等。由于基因編輯后缺失的核苷酸數(shù)量最少是1 bp，也有的是幾個(gè)bp，所以對(duì)于這種小片段的缺失常規(guī)PCR方法無(wú)法進(jìn)行檢測(cè)和分型。功能核酸是指可與特定目標(biāo)物高選擇性結(jié)合［12］或具有催化功能［13］的核酸分子，它具有檢測(cè)、識(shí)別、催化、電子傳遞、發(fā)光等用途。因此可以在常規(guī)PCR方法基礎(chǔ)上引入功能核酸對(duì)小片段的缺失進(jìn)行檢測(cè)和分型。本研究以MSTN編輯牛為研究材料，建立功能核酸PCR（Functional nucleic acid PCR，F(xiàn)NA-PCR）檢測(cè)方法，擬對(duì)MSTN編輯牛進(jìn)行檢測(cè)和基因分型，為基因編輯動(dòng)物檢測(cè)提供一種簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用MSTN編輯牛樣品（編輯位點(diǎn)：AC_000159.1：g.1102 del GAGTGT）和對(duì)照樣品由內(nèi)蒙古大學(xué)提供。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用氯仿苯酚法提取樣品DNA［14］。DNA濃度由核酸測(cè)定儀檢測(cè)得到。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 使用Primer Premier 5.0軟件，針對(duì)編輯位點(diǎn)的兩種等位基因設(shè)計(jì)兩條不同的正向引物和一條共用的反向引物，其中一條正向引物是用于檢測(cè)野生型等位基因：MSTN-WT-F：5′-ATGCTC GAGGCTTATCTATAGCATTGAAGATTACCATGCCCAC GGAGTGT-3′，3′端終止于編輯位點(diǎn)，同時(shí)對(duì)它的5′端進(jìn)行功能核酸接頭設(shè)計(jì)，即添加29 bp功能核酸序 列（ATGCTCGAGGCTTATCTATAGCATTGAAG）。本研究所用的功能核酸是與牛基因組序列不同源的一段核酸序列。另一條正向引物用于檢測(cè)編輯型等位基因 ：MSTN-KO-F ：5′-ATTACCATGCCCACGGAGTAG-3′，3′端跨越編輯位點(diǎn)向后延伸6 bp。共用的反向引物 ：MSTN-R ：5′-CTCTTTCCCCTCCTCCTTACA-3′，它位于編輯位點(diǎn)下游（圖1）。引物MSTNWT-F和MSTN-R用于檢測(cè)野生型等位基因擴(kuò)增片段為175 bp，MSTN-KO-F和MSTN-R用于檢測(cè)編輯型等位基因擴(kuò)增片段為140 bp。引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

圖1 引物設(shè)計(jì)示意圖

1.2.3 FNA-PCR反應(yīng)體系和條件優(yōu)化 分別以野生型和編輯雜合型（+/-）樣品基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化，引物終濃度梯度如表1，并設(shè)置退火溫度為60℃、61℃、62℃、63℃ 4個(gè)梯度，三條引物添加在同一體系進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物用 2.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

表1 FNA-PCR反應(yīng)體系和條件優(yōu)化引物濃度梯度表

1.2.4 靈敏度測(cè)試 將MSTN編輯牛基因組DNA進(jìn)行稀釋得到含25 ng、15 ng、10 ng、1 ng、0.1 ng和0.01 ng的樣品，然后按照已經(jīng)優(yōu)化好的體系（表2）進(jìn)行方法靈敏度測(cè)試。

表2 FNA-PCR反應(yīng)體系

1.2.5 不同基因型的檢測(cè) 選取5個(gè)不同基因型個(gè)體，用建立的方法進(jìn)行鑒定及基因分型。

2 結(jié)果

2.1 FNA-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

將針對(duì)編輯型和野生型等位基因設(shè)計(jì)的正向引物及它們共用的反向引物在同一體系中進(jìn)行引物濃度和退火溫度的優(yōu)化。當(dāng)以野生型牛基因組DNA為模板時(shí)，在所有條件下都只擴(kuò)增出一條175 bp目的條帶，說(shuō)明只有引物MSTN-WT-F和MSTN-R發(fā)揮作用，引物之間無(wú)互作且特異性好（圖2）。且當(dāng)MSTN-WT-F引物終濃度為0.2 μmol/L、退火溫度為60℃時(shí)擴(kuò)增條帶最亮；當(dāng)以編輯雜合（+/-）型牛基因組DNA為模板時(shí)，所有條件下都可見(jiàn)兩條明顯的目的條帶（一條是175 bp，另一條是140 bp），且在引物終濃度為 MSTN-WT-F：0.2 μmol/L，MSTNKO-F ：0.4 μmol/L，MSTN-R ：0.6 μmol/L，退火溫度為60℃時(shí)，擴(kuò)增出較亮，更易區(qū)分，且引物二聚體相對(duì)較弱的目的條帶（圖3）。綜合兩種不同類(lèi)型模板體系優(yōu)化結(jié)果可知最優(yōu)條件為：0.2 μmol/L MSTNWT-F，0.4 μmol/L MSTN-KO-F，0.6 μmol/L MSTN-R的引物終濃度，和60℃退火溫度。

圖2 野生型牛基因組DNA不同引物濃度及退火溫度的PCR結(jié)果

2.2 FNA-PCR靈敏度測(cè)試

圖3 編輯雜合型（+/-）牛基因組DNA不同引物濃度及退火溫度的PCR結(jié)果

按照上述已經(jīng)優(yōu)化好的體系對(duì)含25 ng、15 ng、10 ng、1 ng、0.1 ng和 0.01 ngMSTN編輯牛基因組DNA成分樣品進(jìn)行靈敏度檢測(cè)。結(jié)果顯示，0.1 ng及以上所有含量梯度均能特異性擴(kuò)增出預(yù)期兩條目的片段，即在反應(yīng)體系中含0.1 ng的MSTN編輯牛基因組DNA就可被檢測(cè)出，并可對(duì)其進(jìn)行有效鑒別，表明本文中方法的檢出限為0.1 ng（圖4）。

圖4 引物靈敏度檢測(cè)結(jié)果

2.3 不同基因型的檢測(cè)

利用FNA-PCR方法根據(jù)優(yōu)化好的退火溫度和引物濃度對(duì)5個(gè)個(gè)體進(jìn)行鑒定及基因分型，每個(gè)個(gè)體設(shè)置2個(gè)重復(fù)。檢測(cè)結(jié)果（圖5）顯示，所有檢測(cè)結(jié)果中均沒(méi)有非特異性擴(kuò)增，條帶清晰，且雜合型個(gè)體中兩條擴(kuò)增條帶大小差異明顯。以野生型牛個(gè)體DNA為模板只能擴(kuò)增出一條目的片段（175 bp）；以MSTN編輯雜合型（+/-）牛個(gè)體DNA為模板可同時(shí)擴(kuò)增出大小為175 bp和140 bp的目的片段，從而實(shí)現(xiàn)基因編輯牛和野生型牛個(gè)體的有效檢測(cè)。

圖5 MSTN編輯牛樣品FNA-PCR檢測(cè)結(jié)果

3 討論

自2008年我國(guó)啟動(dòng)轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專(zhuān)項(xiàng)后，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物如轉(zhuǎn)人乳清白蛋白［15］、人溶菌酶［16］、人乳鐵蛋白［17］的轉(zhuǎn)基因牛羊等不斷被研發(fā)出來(lái)并將成為新型的育種材料。由于轉(zhuǎn)入外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物一直受到社會(huì)質(zhì)疑，轉(zhuǎn)基因生物的研制方向逐漸向內(nèi)源基因的編輯方向發(fā)展，為此基因編輯技術(shù)將成為未來(lái)研究的熱點(diǎn)。2018年7 月25 日，歐盟通過(guò)了“由基因編輯技術(shù)獲得的生物品種，將被作為轉(zhuǎn)基因生物（GMO），納入歐盟嚴(yán)格的轉(zhuǎn)基因監(jiān)管框架中”的裁決，因此迫切需要建立針對(duì)基因編輯產(chǎn)品的檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)，對(duì)基因編輯產(chǎn)品進(jìn)行快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)。本研究建立的FNA-PCR方法通過(guò)一次PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳，不僅可以對(duì)基因編輯個(gè)體進(jìn)行檢測(cè)，還可以對(duì)其基因型進(jìn)行判定。FNA-PCR與其它基因編輯生物鑒定或基因分型方法相比具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，與PCR-RE方法相比，F(xiàn)NA-PCR不受限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的限制，而PCR-RE法需要存在酶切位點(diǎn)才可以進(jìn)行檢測(cè)［18］；與T7EI和Surveyor核酸酶法相比，F(xiàn)NA-PCR能夠準(zhǔn)確地對(duì)基因型進(jìn)行區(qū)分，而T7EI和Surveyor核酸酶法無(wú)法實(shí)現(xiàn)此目的［19］；與本文方法相比，HRM法需要特殊的設(shè)備，成本較高［20］。

FNA-PCR反應(yīng)中引物的設(shè)計(jì)是獲得成功的關(guān)鍵之一。FNA-PCR的引物設(shè)計(jì)比傳統(tǒng)PCR引物的設(shè)計(jì)更加巧妙，既可對(duì)編輯樣品進(jìn)行檢測(cè)又能對(duì)其進(jìn)行基因分型。因此設(shè)計(jì)引物時(shí)應(yīng)該考慮以下幾個(gè)問(wèn)題：（1）用于檢測(cè)編輯型等位基因的引物不能在野生型等位基因檢測(cè)中發(fā)揮作用，因此，本研究在正向引物的3′端進(jìn)行了創(chuàng)新性設(shè)計(jì)，即兩條正向引物中的一條3′端終止于編輯位點(diǎn)，另一條跨越編輯位點(diǎn)再延伸幾個(gè)bp；（2）由于基因編輯后缺失的片段較小，利用傳統(tǒng)的PCR方法無(wú)法實(shí)現(xiàn)編輯型和野生型的一次性檢測(cè)，所以我們?cè)趥鹘y(tǒng)PCR的基礎(chǔ)上進(jìn)行創(chuàng)新，即在引物5′端連接與本物種基因組序列不同源的功能核酸接頭設(shè)計(jì)，這種設(shè)計(jì)可使野生型和編輯型等位基因擴(kuò)增出大小不同且易于區(qū)分的產(chǎn)物；（3）擴(kuò)增片段不宜過(guò)大，最好小于300 bp，以使相差幾十bp的片段，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳可以得到明顯區(qū)分。

4 結(jié)論

以MSTN編輯牛為研究材料，在傳統(tǒng)PCR的基礎(chǔ)上進(jìn)行功能核酸接頭設(shè)計(jì)的創(chuàng)新，建立的FNAPCR方法不僅能夠快速地檢測(cè)出基因編輯動(dòng)物，還能對(duì)其進(jìn)行分型。本方法簡(jiǎn)便、靈敏度高、成本低，為基因編輯動(dòng)物的檢測(cè)提供了新思路。