分子標記輔助選擇不同甜瓜性別植株

范磊 戴冬洋，2 熊安平 盛云燕 于明珠 秦瑛聰

（1. 黑龍江八一農墾大學農學院，大慶 163319；2. 石河子大學農學院，石河子 832003）

甜瓜（Cucuumis meloL.）是葫蘆科重要的經濟作物之一，性別分化類型豐富，主要受兩個基因控制——A基因和G基因［1，2］。G基因（WIP1）抑制心皮發育導致雄花發育。研究表明，CmACS7在甜瓜完全花早期發育過程中引起雄蕊退化，產生雌雄異花同株和全雌系［2］。其中全雌系植株的產生是由于一個hAT轉錄因子家族的插入而引起的［1］。甜瓜性別分化是甜瓜單性材料育種的重要理論依據，而甜瓜單性花育種是培育新品種的重要目標之一。但是，通過傳統表型選擇方法篩選單性甜瓜材料，不僅要求豐富的經驗而且耗費大量的人力、物力，而且甜瓜性別分化容易受多條件限制，培育優良單性品種需花費7-8年甚至十幾年時間。因此，提高選擇的效率和減少育種過程中的盲目性是育種工作的關鍵。

分子標記輔助選擇（Marker-assisted selection，MAS）可以從分子水平快速準確地分析個體的遺傳組成。前人甜瓜QTL主效基因的定位和克隆進行了較多的研究［5-8］，但是應用到分子標記輔助選擇育種過程中的標記較少。甜瓜性別分子標記研究較多［9-12］，主要集中在控制雄全同株Cm-Acs-7（A基因）基因位點，張喬玲等［10］甜瓜純合單性花材料與兩性花材料在CmACS-7（A）基因缺失位點開發出了InDel-1標記，用于甜瓜性別早期選擇。李鳳梅等［11］建立了甜瓜單性花Cm-ACS7分子標記體系。前期研究主要集中在單性花基因Cm-ACS7上，對于共同篩選A、G基因的報道相對較少。

本研究利用已經克隆的甜瓜2個性別基因，設計分子標記，在苗期，利用A和G基因鑒定甜瓜的性別類型，可以大大縮短選擇育種的年限，加速分子聚合育種的進程，為甜瓜其他性狀的分子標記輔助育種提供方法。

1 材料與方法

1.1 材料

甜瓜母本為WI998，厚皮網紋甜瓜，全雌系；父本為TopMark，厚皮網紋甜瓜，雄全同株，二者均來源于美國威斯康星大學瓜類遺傳育種研究室。以單粒傳的方式獲得F8重組自交系群體，選擇47個家系（以WT命名，按照順序編號，每個家系種植12個單株）用于分子標記輔助選擇，同時選擇14份甜瓜材料為驗證材料（表1）。

表1 供試甜瓜材料

1.2 方法

1.2.1 分子標記 選擇甜瓜兩片真葉展開時的新鮮葉片組織，利用CTAB法提取DNA，DNA濃度為15-50 ng/L。 根 據 NCBI genbank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/） 公 布 的 甜 瓜 A 基 因（CmACS-7，ID：103492295）和G基因（WIP1+Gyno-hAT，ID：103491671）序列設計引物，CmACS-7轉化Caps標記，命名為Cmacs7，引物序列為F：5′-CAGTGGCACCAGCAGTTA-3′；R ：5′-GGAAAGCGTATGATGAAG-3′，利用AluⅠ對其產物進行酶切。G基因位點設計2個引物，區分是否含有Gyno-hAT插入位點的引物 Cmhat：F ：5′-ATGGCAGACAGATTGTTATTAGTG-3′；R ：5′-GAGTAGAAGGTACTCCAAATGAATGGC-3′；區分G（g）位點雜合與純合性引物Cms，F ：5′-CGGTTCGGTCCAGTAACATT-3′；R ：5′-AGGGGGAAGAAAAAGGGATT-3′。

PCR反應體系采用10×擴增緩沖液1 μL（MgCl2+）、dNTPs（1 mmol/L）0.2 μL、引物（5 pmol/L）2 μL、模板 DNA（15-20 ng/μL）1 μL、Taq DNA 聚合酶（1 U/μL）0.1 μL，ddH2O 補至 10 μL。

PCR擴增程序為94℃ 30 s；94℃ 30 s，50-68℃30 s，72℃ 40 s，25個循環；72℃ 5 min。擴增產物經8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，拍照。Cmacs-7擴增產物在37℃下酶切3 h。

1.2.2 田間性狀調查 2013年、2014年及2018年分別種植驗證材料及重組自交系群體，調查單株開花類型，記錄植株性別：雌雄異花同株（雄花和雌花）、完全花植株（只著生完全花）、全雌株（只著生雌花）和雄全同株（雄花和完全花）；2013年及2014年調查甜瓜重組自交系群體家系每個單株主蔓30節前所有雌花、雄花及完全花的開花率，驗證性別表現；2018年調查植株開花類型；對DNA分子標記檢測結果進行驗證。

2 結果

2.1 CmACS-7基因位點檢測結果分析

利用CmACS-7標記對親本、重組自交系群體及驗證材料進行分析，所有供試材料在 383 bp產生一個位點，經ALUⅠ酶切3 h后，酶切產物分為3種類型（圖1）。當PCR產物在383 bp被全部酶切，該位點所顯示基因型為aa；當PCR產物不能被酶切時，該位點代表AA基因型，當酶切位點和PCR產物位點均有擴增條帶時，代表基因型為Aa，呈雜合狀態。

圖1 甜瓜CmACS-7擴增產物檢測

2.2 重組自交系群體G基因位點的檢測

利用NCBI公布的Gyno-hat序列與WIP1序列，設計2對引物，以期區分純合位點與雜合位點，基因結構示意圖與引物設計原則如圖2所示。由于插入3 kbGYno-hat序列，Cmhat引物擴增條帶過大無法檢測到，因此當Cmhat引物產生擴增條帶（197 bp）時，說明該材料基因型為G，而該位點無產物則基因型為g；在gyno-hat共有序列WIP1連接處設計引物Cms，擴增產物在184 bp有條帶時說明該位點為g，如果無擴增產物則為G。利用2對基因共同擴增待測DNA，即可檢測G基因位點基因型。

2.3 分子標記檢測的準確性

對甜瓜重組自交系群體的47個家系、3個F1及14個純合品系進行分子標記的檢測（表2）。No.3-2-2和WI846為雌雄異花同株，與3年的田間鑒定結果相吻合，而且基因型純合。WI998為全雌系，TopMark為雄全同株，與3年的田間檢測結果吻合，基因型純合。3個雜交組合F1代，分子檢測結果和田間觀察結果相同，基因型為雜合型。

對研究材料開展田間表型鑒定，以單株開花雌花、雄花及完全花的比率確定性別類型，61份材料中，59份材料基因型和表現型結果相互吻合，WT7-2為全雌株（表2）。2013年田間檢測為全雌株，2014年和2018年田間檢測為雌雄異花同株；WT113基因型鑒定為雄全同株，2013年表型鑒定為雄全同株，2014年和2018年鑒定為雌雄異花同株；田間檢測47個甜瓜重組自交系中19個家系為雌雄異花同株，4個家系為全雌株，24個家系雄全同株，1個家系株完全花株。分子標記選擇效率為96.3%。結果表明，通過這兩個分子標記能夠分別鑒定基因純合型和雜合型，并且能較為準確地鑒定甜瓜性別類型。

3 討論

DNA分子標記輔助選擇是通過利用與目標性狀緊密連鎖的DNA分子標記對目標進行間接的選擇，基因克隆技術和分子生物技術的飛速發展，使目的性狀的選擇越來越準確。通過分子標記的早期選擇可以克服隱性基因識別難度的問題，并且能夠區別基因純合型及雜合型，從而提高育種效率，加速育種進程［13-15］。通常情況下，分子標記輔助選擇是根據QTL找到與其緊密連鎖的分子標記，通過標記進行篩選，瓜類作物一些重要的性狀主效QTL的已經被報道［5，16］，這些瓜類性狀緊密連鎖的標記可直接用于分子標記輔助選擇。但是分子生物信息學研究發現，即使與性狀連鎖距離小于1 cm，在連鎖區域包含很多候選基因，而基因間的互作可能影響對目標性狀鑒定的準確性。因此，通過獲得目的基因序列，設計引物，能夠更加直接有效地鑒定目的性狀。

圖2 Cmhat與Cms標記檢測G位點結果

表2 甜瓜重組自交系群體植株與驗證植株性別表達田間鑒定

續表

甜瓜性別基因的研究始終繞著甜瓜性別表達、甜瓜性別基因定位展開，直到2008年甜瓜性別基因A基因和G基因的克隆才為甜瓜性別類型的選擇提供了重要的理論依據［1-2］。本研究根據已經克隆的A基因和G基因，設計引物，目的在于不僅能夠鑒定甜瓜性別，而且還能區分基因純合型及雜合型，可以直接用于甜瓜育種工作。本研究表明分子標記能夠成功地鑒定甜瓜性別類型，而且雜合基因型也能夠準確地鑒定。本研究中WT7-2和WT113基因型鑒定分別為全雌株和雄全同株，由于甜瓜的性別表現受到環境因素等多方面的影響，而且部分雌雄異花同株植株在花芽類型的開放順序也不盡相同（有的早期大量開放雌花，后期開放雄花；有的早期大量開放雄花，后期開雌花），可能是造成田間性狀統計結果不同的原因之一。

此外，本研究種植每個家系12個單株，統計平均值作為田間調查的依據對研究結果也存在一定影響。WT113分子基因型鑒定為雄全同株，2013年田間鑒定結果與分子鑒定結果相同，但是2014年和2018年田間表現均為雌雄異花同株，除了受到環境條件的影響之外，花器官發育相關基因的表達差異也是影響甜瓜性別表達的因素之一［19］。研究者曾經對甜瓜不同性別轉錄組分析，挖掘甜瓜性別相關差異基因的研究中發現，花粉不育基因在雄全同株和雌雄異花同株中差異表達［20］，WT113田間性狀的變化及與分子鑒定結果的不同，也可能是通過環境變化誘導差異基因表達，形成不同植株類型。

4 結論

利用已發表的甜瓜性別基因序列設計分子標記，在甜瓜苗期鑒定雄全同株、全雌株、雌雄異花同株及完全花株，并且能夠區分鑒定基因雜合型位點。