CRISPR/Cas9系統中引導RNA的研究進展

李江 耿立召 許建平

（先正達生物科技（中國）有限公司，北京 102206）

基因編輯是目前生命科學研究的一個熱點，CRISPR/Cas9（The clustered regularly interspaced palindromic repeats/CRISPR-associated 9）是基因編輯技術中的一個重要工具。目前廣泛使用的CRISPR/Cas9是細菌和古細菌的對抗外源DNA入侵的一種防御系統，可將入侵的噬菌體基因組DNA等外源核酸序列切除［1］。自2013年首次報道CRISPR/Cas9在生物體內實現基因編輯以來［2-3］，由于其操作簡單，效率高，所以該系統廣泛應用于動植物，成為藥物開發、疾病治療和農作物品質改良等領域的一個重要基因編輯工具，具有廣泛應用前景［4］。

基因編輯中所用的CRISPR/Cas9系統屬細菌II型的CRISPR/Cas9，由Cas9蛋白和引導RNA（Guide RNA，gRNA）兩種分子組成，其中Cas9蛋白是一種依賴于引導RNA分子的核酸切割酶，只有裝載引導RNA后才能激活自身識別和切割基因組DNA的功能。而引導RNA除激活Cas9活性外，還含有一段與靶基因組DNA反向互補的20 個核苷酸序列，將Cas9蛋白/引導RNA復合體定靶向位于目的DNA序列［1］。目前關于CRISPR/Cas9系統的研究綜述多集中于工作機理、Cas9蛋白的結構與工作模式，以及CRISPR/Cas9系統的應用發展，而對CRISPR/Cas9中的引導RNA研究進展還缺乏系統性回顧。因此，本文將從引導RNA的結構，產生方式以及對基因編輯頻率的影響這幾個方面，對CRISPR/Cas9系統中的引導RNA研究進展進行綜述。

1 引導RNA的序列與結構

在細菌中，CRISPR/Cas9的引導RNA由兩條RNA分子組成，CRISPR RNA（CrRNA）和trans activating CRISPR RNA（TracrRNA）（ 圖 1-a）。crRNA的5′端包含20個堿基與噬菌體基因組DNA互補，并由重復間隔序列串聯構成，轉錄成一條長的RNA分 子（Precursor crRNAs，pre-crRNAs） 后， 經 過RNA 酶III加工過程產生一系列短的40 nt左右的包含間隔序列的成熟crRNA。tracrRNA 具有與crRNA互補的一段序列，crRNA與tracrRNA結合形成部分雙鏈互補的兩個RNA分子復合體［1］。Cas9蛋白首次在體外證明具有切割功能時發現其切割活性是由兩條引導RNA分子參與產生的，只加入CrRNA不 能使Cas9蛋白實現對質粒DNA的切割，只有再加入TracrRNA時才能使Cas9體外切割質粒DNA，獲得與CRISPR/Cas9體內相同的生物學活性［5］。CrRNA 與TracrRNA 有兩個RNA分子組成，crRNA 5′端20個堿基與靶基因互補，與crRNA配對結合后促進CrRNA的成熟。雖然CrRNA與TracrRNA通過互補序列形成的雙鏈分子與Cas9結合后產生的基因編輯在原核生物中應用較好，但在真核生物中因技術復雜難以進行應用。為了便于操作，科學家將CrRNA的3′端與TracrRNA的5′端通過GAAA的核苷酸序列相連，并縮短了雙鏈互補結合區域僅保留4個核苷酸對，形成48 nt的單引導RNA分子（圖1-b），并通過延長3′端37個堿基后（圖1-c），獲得編輯效率很高的單引導RNA分子結構。目前，85nt的單引導RNA序列結構是CRISPR/Cas9在基因編輯中廣泛使用的一個分子結構［2-3，5-8］。

圖1 引導RNA的序列結構變化［9］

目前關于引導RNA的結構研究以是以單引導RNA序列為模型獲得。引導RNA的序列可分為兩部分，5′端1-20個堿基是與目標DNA互補的Protospacer序 列， 它 與 PAM（Protospacer adjacent motif）序列共同決定Cas9蛋白目的DNA序列上的定位，在PAM上有的3-4位核苷酸之間產生雙鏈斷裂。Protospacer之后的核苷酸為引導RNA的折疊結構（Scaffold fold），含有多個RNA二級結構。在這些RNA二級結構中，雙鏈互補區域的14個堿基由CrRNA與TracrRNA的重復序列反向互補形成，其中G27、G28、A41、A42、G43和U44不配對而產生一個突起（Bulge），突起上游的雙鏈序列稱為下位莖（Lower stem），下游的雙鏈序列成為上位莖（Upper stem）。上位莖下游含有3個莖環組成的結構，依次為 Nexus，Hairpin1 和 Hairpin2［10-11］。對引導RNA的二級結構在不同文章中的命名不完全相同，但對應的結構是一致的。通過對Cas9蛋白結合引導RNA和目標DNA序列的形成的晶體結構解析發現，引導的5′端序列與目標DNA序列形成的復合體被Cas9蛋白包裹于充滿負電荷的多肽內部，引導RNA的第10-20個核苷酸稱為種子序列（Seed region），與模板DNA互補形成有序而牢固的雙鏈結構，當種子序列存在2個及以上堿基的與目的DNA序列產生錯配時，Cas9蛋白不能與目的DNA序列牢固結合無法對DNA序列產生切割［12］。引導RNA中的反向互補的雙鏈重復序列結構被Cas9蛋白的識別結構域（Recognition，REC）和核酸酶結構域（Nuclease，NUC）以序列依賴的方式識別。此結構中的非互補突起部分及相鄰的核苷酸是Cas9蛋白識別的核心序列，而末尾的C30∶G39和A32∶U37不被Cas9蛋白識別而突出于Cas9蛋白表面，提示此部分雙鏈互補序列是經RNA酶III加工產生的。引導RNA雙鏈互補結構下游的三個莖環結構是穩定Cas9蛋白與引導RNA復合體的重要序列。其中Nexus的序列中有部分核苷酸（52、53和59-61）是被Cas9蛋白的REC結構域和NUC結構域中的1103-1107 位的氨基酸結合，被PAM激活結構域（PAM-interacting，PI）所識別，與雙鏈重復互補序列中的突起結構共同參與激活Cas9蛋白對PAM序列的識別，引導RNA打開Cas9蛋白的結構去識別PAM序列［13］。其余兩個莖環結構Hairpin1和Hairpin2的大部分序列暴露于Cas9蛋白表面，只有Hairpin1中的63-65、67和Hairpin2中的92位核苷酸被Cas9蛋白的NUC結構域識別［10］，這兩個莖環可以提高Cas9蛋白與引導RNA復合體的穩定性，并且這段區域中的核苷酸能容忍較大范圍的改變，是改造引導RNA的一個可行區域［11-12，14］。可見，引導RNA的雙鏈復合體和Nexus是Cas9蛋白行使功能所必需的結構，而Hairpin1和Hairpin2以及之間的5個連接堿基可幫助穩定Cas9蛋白與引導RNA及目標DAN形成的復合體，突變將影響Cas9蛋白的切割效率。

引導RNA的序列特征在Type II的 CRISPR-Cas9系統中具有保守性。在Streptococcus和Lactobacillus中分離到的41 種Cas9基因中，盡管Cas9的蛋白序列根據一致性可分為3組，但引導RNA中CrRNA與TracrRNA反向重復序列結合的雙鏈序列高度保守，都存在不配對的核苷酸突起結構以及相鄰的上下位莖序列，是II型CRISPR/Cas9特有的結構。但核苷酸組成和上下位莖的長度在不同來源的Cas9中差異很大，其中較短的下位雙鏈序列長度保守，較長的上位雙鏈序列長度在不同種類的菌中變異較大。但最為保守的部分為TracrRNA的第一個莖環，甚至在不同菌中都含有高度一致的堿基，如A52和C55與Cas9蛋白的1 103-1 107 位的氨基酸結合［10］。對S. thermophiles中的兩個同源Cas9蛋白Sth1Cas9和Sth3Cas9以及對應的引導RNA序列CRISPR1 sgRNA和CRISPR3 sgRNA進行置換，未能檢測到Sth1Cas9和Sth3Cas9的切割活性。然而當CRISPR1 sgRNA含有 CRISPR3 的Protospacer 序列后可以使Sth3 Cas9產生切割活性。進一步對兩種引導RNA的莖環同時進行互換后發現，人工產生的引導RNA不能使原對應的Cas9蛋白產生切割活性，但使異源的Cas9產生了切割活性。而只互換其中的一個莖環不足以產生這種效果［10］。說明引導RNA的序列結構在不同類型的CRISPR/Cas9中具有獨特性，表明CRISPR/Cas9系統進化具有不同的分支；也表明引導RNA對CRISPR/Cas9系統發揮功能具有非常重要的決定作用。

2 引導RNA的產生方式

引導RNA在細菌和古細菌中由體內的RNA 轉錄系統產生，但在CRISPR/Cas9應用于基因編輯技術時，需要在體內表達人工設計的引導RNA，引導RNA的5′端1-20個核苷酸對應目的DNA序列不同而做改變，使Cas9蛋白在特定預期位點產生切割。引導RNA的產生是CRISPR/Cas9基因編輯技術中的重要過程，引導RNA需要滿足以下要求：（1）引導RNA保持在細胞核內。（2）產生的引導RNA的5′端不能有與目的序列不配對的多個額外核苷酸。針對不同的基因編輯需求，CRISPR/Cas9的引導RNA有不同的產生方式，會對最終基因的編輯效果產生顯著影響。

2.1 單引導RNA轉錄

CRISPR/Cas9人工構建的引導RNA的5′端1-20核苷酸與靶DNA序列互補，不能有額外的多個核苷酸序列，因此引導RNA最初都是由聚合酶III型啟動子（Pol III promoter）轉錄產生。在植物過表達技術中應用廣泛的II 型啟動子是一類表達強，在基因過表達中廣泛使用的一類生物體內源啟動子，如CaMV 35S 啟動子、玉米泛素啟動子（Ubiquitin）啟動子等。但這類啟動子轉錄的RNA是前體結構，如mRNA 前體，microRNA前體和一些小的核RNA前體等，這些非成熟的RNA前體會經過體內加工系統，實現5′ 加帽和3′加尾，并且切除內含子。因此II型啟動子不能用于CRISPR/Cas9系統中引導RNA的轉錄［15］。III型啟動子是轉錄5s RNA，tRNA和小的非編碼RNA的啟動子。在CRISPR/Cas9中常用的Pol III啟動子有U3和U6兩類，在哺乳動物細胞中產生引導RNA為U6，在植物中產生引導RNA為U3和U6，U3和U6啟動子在轉錄引導RNA產生基因編輯的頻率上沒有差別［2-3，6，16］。U3 啟動子的轉錄產物第一個堿基固定是A，而U6啟動子的轉錄產物第一個堿基固定是G，因此引導RNA的5′端序列需根據U3或U6的使用進行調整，如5′GN（19）NGG 和 5′AN（19）NGG［17］。在使用 Pol III啟動子轉錄產生引導RNA時，通常一個U3或U6啟動子只能產生一個引導RNA分子去實現一個靶位點的切割。當需要產生多個引導RNA時，需要將這類啟動子重復使用去驅動多個引導RNA產生［18］。

U3和U6啟動子在CRISPR/Cas9基因編輯中廣泛用于引導RNA的轉錄，但具有一定的局限性。U3和U6啟動子是組成型表達啟動子，不具備組織特異性表達，這導致引導RNA的產生無法在時空上進行調節，不能實現條件誘導性的基因編輯。生物體內的U3和U6啟動子分布廣、種類多，不同種屬之間序列差異大，同一物種中的啟動子活性也不同。啟動子的有些調控元件位于轉錄起始位點下游內，容易導致克隆的啟動子序列不完整，影響啟動子活性［15］。近來也有研究報道通過RNA聚合酶II型啟動子轉錄一條包含Cas9 和引導RNA的轉錄本，這條轉錄本中的引導RNA可被RNaseIII途徑加工后，與Cas9結合在水稻中產生高頻率的基因編輯活性［19-20］。

2.2 多引導RNA轉錄

當 CRISPR/Cas9要對體內多個靶點實現基因編輯時，需要產生多個引導RNA與目的序列位點結合。多個引導RNA的產生最早是用U3或U6啟動子交替重復使用，每個啟動子對自身下游的引導RNA序列進行轉錄。采用此策略在水稻和擬南芥中可同時分別轉錄6個引導RNA產生，獲得16%的純和突變體的靶位點編輯頻率［21］。雖然這個方法可以得到多個靶位點的突變體，但利用U3/U6重復表達多個引導RNA有以下不足：（1）由于引導RNA長度很短，并且要求引導RNA的5′末端為A/G，3′末端需要為5個及以上的poly（T）作為終止信號，克隆構建策略有限，無論是采用DNA合成還是多個片段拼接，引導RNA轉錄單元串聯的載體十分具有挑戰性。目前文章報道采用的策略均在Golden Gate的技術上做改進，最多可將5個引導RNA表達單元裝入一個載體，而6個以上的引導RNA表達單元組裝效率很低［16］。（2）串聯重復的引導RNA表達單元包含啟動子后在300-600個堿基左右，其中只有與目的基因序列互補的20 個堿基作為Protospacer有變化，其余序列均為重復序列。過多的重復序列容易造成載體在細菌和農桿菌中的不穩定。（3）由于多引導RNA轉錄結構的串聯，容易在植物體內誘發基因沉默，造成引導RNA的低水平或不表達。以上這些因素使U3或U6啟動子重復使用產生多個引導RNA的基因編輯技術存在很大的挑戰［21］。

近年來，多個引導RNA的產生是CRISPR/Cas9基因編輯技術中的一個研究熱點。在生物體內存在可以從一個RNA轉錄本中產生多個RNA分子的機制，如多順反子mRNA前體在轉錄后加工過程中被RNA酶剪切后可產生多個獨立的引導RNA分子。因此，可以利用生物體內的RNA剪切加工過程從一個RNA轉錄本中同時產生多個引導RNA分子。目前報道在CRISPR/Cas9系統中利用3種RNA剪切過程實現多個引導RNA的產生：來源于Pseudomonas aeruginosa的Csy4的RNA切割酶，tRNA序列介導的內源RNA酶剪切和病毒來源的核酶剪切系統。Csy4作為外源RNA切割酶，多個引導RNA被其20個核苷酸的識別序列間隔開，Csy4識別這段序列并切割間隔序列的3′末端，可釋放兩個Csy4識別序列之間的引導RNA分子，產生的引導RNA的5′端沒有額外核苷酸存在而3′端帶有Csy4的20nt的識別序列［22］。2017年，有研究將Csy4通過2A肽與Cas9蛋白融合表達，引導RNA通過Csy4識別序列串聯，可在體內通過能從一個RNA轉錄本上同時產生12個引導RNA分子［23］。生物體內還存在一類tRNA加工的RNA 剪切加工系統，常用的是tRNAGly是一段77nt 的核苷酸形成的一個包含3個莖環結構的一段RNA序列，其5′端含有一個RnaseP的識別切割位點，3′端含有一個RnazeZ的識別切割位點，在體內通過內源核酸酶將tRNA序列的兩個位點切割從而釋放引導RNA。當多個引導RNA通過在5′和3′端連接有77 nt 的tRNA序列進行串聯時，核酸酶加工切割過程可從一個RNA分子上釋放多個引導RNA，產生的引導RNA的3′端經RNaseZ切割后殘留6個tRNA序列的核苷酸而5′不含額外的核苷酸［24-25］。tRNAGly序列在動植物中均存在，介導的多個引導RNA轉錄釋放技術在CRISPR/Cas9技術中得到了廣泛使用，通過此方法實現了同時對動植物體內多個位點進行基因編輯，有報道最多可一次產生8個引導RNA分子［23］。此外，與tRNAGly序列釋放引導RNA的過程類似，在引導RNA的5′端和3′端各加上一種核酶序列，5′端是Hammerhead（HH）type ribozyme，3′端 是 Hepatitis delta virus（HDV）ribozyme，這種結構形成的引導RNA分子稱為 RGR（Ribozyme-gRNA-Ribozyme，RGR）。RGR可利用核酶序列間隔，將多個引導RNA分子串聯轉錄后，引導RNA兩側的核酶序列被體內核酸酶識別并切除，從而釋放有活性的引導RNA分子，但這兩種核酶的切割活性較tRNA結構要低很多［23］，并且在需要引入動物病毒的核酶序列，在植物應用中有很大局限。但tRNA結構不同，這兩種核酶在SP6啟動子介導的體外轉錄過程中，可被SP6 RNA聚合酶在轉錄過程中識別并切除［26］。

以上3種策略中，Csy4和tRNA介導的多個引導RNA在體內產生并實現多靶位點的基因編輯頻率相當，而遠遠高于HH ribozyme和HDV ribozyme核酶產生的引導RNA。有報道表明Csy4核酸酶不會對植物體產生負表型影響，而且Csy4的識別序列只有20個核苷酸，遠短于tRNA的77個核苷酸序列，有利于載體的構建和穩定［23］。tRNA的切割加工是生物體的一個基本活性過程，因此tRNA介導的多個引導RNA的產生可廣泛用于動植的基因編輯，是多位點CRISPR/Cas9基因編輯的一個研究熱點［15，23-25］。而 HH ribozyme 和 HDV ribozyme核酶能被SP6識別并切割，因此更適用于體外轉錄產生多個引導 RNA 的應用［15，26］。

2.3 體外產生引導RNA

在CRISPR/Cas9基因編輯技術中，Cas9和引導RNA可以在體外產生后組裝成蛋白核酸復合體（Ribonucleoproteins，RNPs），導入細胞體內實現靶位點DNA編輯。體外產生引導RNA主要由用商品化的T7體外轉錄試劑完成，引導RNA的DNA序列5′端含有T7啟動子序列和轉錄起始位點［27-28］。體外轉錄的引導RNA可以是單分子形式，也可以是CrRNA和TracrRNA兩個分子。引導RNA也由化學合成的方法在體外產生，常用的方法是固相基質上如利用 2′-silyl，2′-bis-methylther等化學合成方法。但單引導RNA的分子長度接近100個核苷酸，合成的成本和難度大，因此通常采用CrRNA和TracrRNA兩個分子的形式［29］。

3 優化引導RNA提高基因編輯效率

CRISPR/Cas9雖然廣泛應用于各種動植物體的基因編輯，但在一些生物體中仍存在效率低的問題，如小麥等［30］。此外，同源重組介導的核苷酸定點插入和替換的效率依賴于Cas9的切割效率。群體中足夠多的雙鏈斷裂（Double strand break，DSB）是實現同源重組的必要條件，而引導 RNA 5′端的序列結構是影響同源重組效率的另一因素［31］。因此，提高CRISPR/Cas9的基因編輯效率對這項技術的廣泛和深入應用有重要意義。引導RNA作為CRISPR/Cas9的重要組成之一，引導RNA的序列、高級結構以及表達方式對CRISPR/Cas9的基因編輯效率有顯著影響［32］。

3.1 引導RNA序列組成對基因編輯效率的影響

引導RNA的序列由與目標DNA序列互補的Protospacer和Scaffold 兩部分組成。5′端的1-20個核苷酸是與目標序列互補的一段序列，其中的核苷酸組成會影響基因編輯效率，當G和C出現頻率高而A出現頻率低，尤其是GC含量高于50%時，可以提高引導RNA序列與靶基因序列位點結合的穩定性，提高Cas9的切割效率；尤其是靠近靶序列的PAM位點的核苷酸中，20位核苷酸偏好G而避免C，19位核苷酸避免C時，可顯著提高引導RNA產生的編輯效率。此外，引導RNA通常由RNA聚合酶III型的U3或U6啟動子轉錄產生，RNA序列中連續4個及以上的尿嘧啶將成為這類啟動子的終止信號，可導致轉錄的提前終止［33］。在引導RNA內部位于Lower stem的第23-26位4個連續尿嘧啶序列UUUU［23，26-30］是U3或U6啟動子潛在的終止信號，當這四個尿嘧啶分別被突變為A，C，G時，均可提高CRISPR/Cas9的基因編輯效率，尤其是突變為C和G時較A的基因編輯效率高很多；并且第26位的尿嘧啶突變為C時，提高的編輯效率較其他3位的突變最為明顯［9］。這種優化的引導RNA序列在水稻基因編輯中得到了應用［14］。

3.2 引導RNA序列結構對基因編輯效率的影響

引導RNA的二級結構是被Cas9蛋白識別并產生功能的重要序列。利用熒光探針淬滅技術研究不同序列缺失的引導RNA與Cas9蛋白體外結合時發現，缺失第一個莖環（Nexus）將導致Cas9蛋白不能結合引導RNA，這與Cas9蛋白結合引導RNA的晶體結構相吻合，缺失第2個莖環（Hairpin1）和第3個莖環（Hairpin2）時，Cas9蛋白結合引導RNA的效率要降低很多，尤其是與總RNA共同混合時尤其明顯。說明引導RNA的二級結構是CRISPR/Cas9產生基因編輯的重要部分，還對引導RNA在細胞內特異性被Cas9蛋白識別結合有作用［34］。應用于CRISPR/Cas9基因編輯系統中人工創造的引導RNA序列中，雙鏈互補區的序列比天然crRNA：tracrRNA的雙鏈互補區截短了10個堿基對，目前關于引導RNA二級結構優化提高CRISRP/Cas9基因編輯效率的研究集中在這部分序列。當延長這部分序列從1、3、5、8和10個堿基對時，發現延長5個堿基對時引導RNA的基因編輯效率可達到最大［9，35］。在水稻中，延長雙鏈結合區5個堿基對并疊加第26位的尿嘧啶突變為C時，這種類型的引導RNA結構比現有序列的基因編輯提高13倍［14］。此外，對引導RNA的3′端添加G3U3或G2U1的特定核苷酸序列，通過提高引導RNA在體內的穩定性而提高CRISPR/Cas9的切割效率并降低脫靶率［36］。

3.3 RNA聚合酶II啟動子轉錄引導RNA對基因編輯效率的影響

在CRISPR/Cas9基因編輯中，引導RNA通常由RNA聚合酶III型轉錄產生，但由于這類啟動子的強度較常用的II型啟動子強度低，限制了CRISPR/Cas9的編輯效率。在多引導RNA產生中發展來的幾種多順反子RNA切割系統，可以使引導RNA的5′端不受RNA聚合酶III啟動子限制，而是用強度更大的RNA聚合酶II型啟動子轉錄引導RNA。在番茄原生質體中，用CmYLCV（Cestrum Yellow Leaf Curling Virus promoter）啟動子驅動tRNAGly和Csy4介導的兩種引導RNA轉錄，對黃色熒光蛋白（Yellow fluorescent protein，YFP）的編輯效率比U6啟動子驅動的引導RNA要高2倍［21］。考慮到RNA聚合酶II型啟動子的35S 和Ubiquitin啟動子常用于驅動Cas9表達盒，為了避免載體含有重復的大片段，目前有多個RNA聚合酶II型啟動子以供引導RNA轉錄，除前文提到的植物病毒來源的CmYLCV啟動子，還有細菌來源的M24和Nos以及植物來源的 AtUbi10，OsAct1，PvUbi1和 PvUbi2等， 甚 至有組織特異性的啟動子如Arabidopsis Ec1.2 和YAO promoter可供引導RAN實現植物卵細胞，囊胚和花粉中的特異表達［21，37］。

4 總結與展望

CRISPR/Cas9系統作為基因編輯重要的一個工具，已經廣泛用于各種生物體的特定核苷酸的缺失和改變，以及特定基因的轉錄調控等。引導RNA作為CRISPR/Cas9系統中的核心元件之一，對其序列和結構的研究不僅加深人們認識CRISPR/Cas9的自然分類、工作原理，而且為CRISPR/Cas9系統的優化和拓展具有重要價值［38-39］。最近報道在引導RNA的3′端添加用于同源重組介導的RNA形式的供體序列，在Cas9蛋白產生的雙鏈斷裂缺口處完成供體RNA鏈與目的DNA序列鏈的置換，可以大幅提高核苷酸的定點編輯的效率［40］。此外，引導RNA的保守序列部分為新CRISPR-Cas系統的發掘提供重要的信息和證據［41］。