母牦牛生殖系統中低氧誘導因子基因的表達分析

何向東 夏憶 吉格莫體 王會 字向東

（西南民族大學動物科學國家民委重點實驗室，成都 610041）

低氧誘導因子（Hypoxia inducible factor，HIF）是動物低氧生理反應的重要轉錄因子，由α和β亞基組成的異二聚體，其中α亞基受氧調節，是調節HIF活性的功能亞單位。目前已知的α亞基有HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α三種。在哺乳動物處于低氧環境下，HIF-1α和HIF-2α因子的蛋白質穩定性和體內轉錄潛力均顯著提高［1］，進而調控HIF下游基因，特別是關于糖酵解相關基因（如GLUT1、LDHA和VEGF）表達，通過增加糖酵解效率、促進血管生成和增加葡萄糖轉運等途徑來維持其在缺氧環境中的生存和對抗缺氧損傷［2］。低氧分壓通過HIF-1α影響卵母細胞的成熟、黃體的形成與早期胚胎的發育［3］，但是，慢性低氧也會引起動物繁殖能力下降［4］。HIF-2α又稱內皮 PAS蛋白 1（EPAS-1），刺激胚胎分泌兒茶酚胺，調節胚胎發育［5］。小鼠子宮缺失HIF-2α會造成小鼠不孕不育，而小鼠子宮缺失HIF-1α會造成小鼠繁殖能力下降［6］。雖然世居高原的動物對高原低氧有一定的適應能力，但雌性高原鼠兔（Ochotona curzoniae）的窩產仔數也隨著低氧程度的提高而下降［7］。目前，動物繁殖機能對低氧環境適應其分子調控機制的有待深入研究。

牦牛（Bos grunniens）是生活在青藏高原高海拔低氧地區的物種，是高原人民的主要生活資料和生產資料［8］。牦牛為季節性發情動物，生殖系統發育緩慢，性成熟晚，繁殖性能低［9］。黃牛則主要分布在海拔2 000 m以下的地區，為常年發情動物［10］。因此，本研究以母牦牛和母黃牛為研究對象，運用RT-qPCR 技術對HIF-1αmRNA 與HIF-2αmRNA 在兩物種生殖軸的表達差異進行分析，探討牦牛生殖機能對高原低氧環境的適應調控機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 在2017年10月，實驗選取5頭4-5歲紅原（海拔3 000 m）放牧飼養、處于卵泡期的健康母牦牛和5頭4-5歲巴中（海拔1 500 m）放牧飼養、處于卵泡期的健康母黃牛，于四川省成都市青白江唐家寺屠宰場現場屠宰。使用無菌剪刀剪取下丘腦、腦垂體、卵巢、輸卵管和子宮組織。組織樣用生理鹽水沖洗干凈，投入液氮罐，快速運回實驗室，保存備用。

1.1.2 主要試劑、儀器 Trizol Reagent為美國Invitrogen公司產品；DNA Marker DL2000，2×Taq PCR Master mix為上海天根公司產品；反轉錄試劑盒（RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit）為Thermo Scientific公司產品；DH5α感受態細胞為康迪生物技術有限公司產品；克隆載體pMD-19Vector、IPTG、X-Gal和氨芐青霉素均為大連寶TaKaRa生物工程有限公司產品；Green Supermix 為 DBI?BIOSCIENCE公司產品；DNA膠回收試劑盒（AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit）為北京Axygen公司產品；RT-qPCR儀（CFX6）為美國Bio Rad公司產品；瓊脂糖凝膠成像系統（GEL DOC2000）為美國Bio Rad公司產品；PCR儀（ETC811）為蘇州東盛興業科學儀器有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據NCBI公布的牦牛HIF-1α（ 登 錄 號 ：AY621118.1）、HIF-2α（ 登 錄號：KJ617390.1）和內參基因GAPDH（登錄號：EU195062.1）設計熒光定量引物（表1），引物由成都擎科梓熙生物技術有限公司合成。

表1 HIF-1α、HIF-2α和GAPDH熒光定量引物

1.2.2 總RNA提取和cDNA第一鏈合成 將分別采集的牦牛和黃牛下丘腦、腦垂體、卵巢、輸卵管和子宮組織各取0.5 g左右放入預先用液氮冷卻的研缽內，用研磨棒將各組織研磨成白色粉末狀，采用Trizol法分別提取牦牛和黃牛的生殖軸的總RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性并用紫外分光光度計檢測RNA濃度。反轉錄前檢測RNA的濃度為100 ng/μL。cDNA合成采用Thermo Scientific試劑盒進行反轉錄，轉錄程序按照說明書進行。反轉錄后，將得到的cDNA分別作為常規PCR和RT-qPCR模板，置于-20℃冰箱備用。

1.2.3 常規PCR檢測引物特異性 以牦牛和黃牛下丘腦cDNA為模板，利用常規PCR檢測HIF-1α、HIF-2α和GAPDH引物特異性。常規PCR反應體系為 25 μL ：Taq 酶（5 U/μL）12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上游引物（100 μmol/μL）各 1 μL，cDNA1 μL。反應程序：94℃預變性3 min；94℃變性 30 s；退火30 s（溫度見表1）；72℃延伸30 s，循環39次；72℃終延伸5 min。反應結束后，將0.5 μL pMD-19Vector、4.5 μL純化回收產物和5 μL Solution于16℃金屬浴中反應過夜，保證連接徹底。連接后的產物再轉化100 μL宿主菌E. coliDH5α感受態細胞，經過冰浴、熱激活等步驟后均勻涂布于含有0.1%的氨芐青霉素（Amp）的LB固體培養基上，涂布至干后封口倒置于37℃恒溫培養箱中培養12 h。在超凈工作臺中，用滅菌槍頭挑取白色單克隆菌落于含有Amp（濃度為0.1%）的LB液體培養基中，37℃ 180 r/min。震蕩培養8 h至菌液渾濁。取1 μL菌液作為模板進行PCR擴增反應及電泳檢測鑒定后，最后挑選含目的基因片段的陽性單克隆菌液送至成都擎科梓熙生物技術有限公司進行測序。

1.2.4 制備標準品 將PCR產物做膠回收作為制備標準品的模板，回收步驟按說明書進行，進行倍比稀釋制作標準品，方法參照［11］。

1.2.5 繪制標準曲線 依次從稀釋5個梯度的標準品中各取2 μL作為cDNA模板進行qRT-PCR反應，反應體系25 μL：cDNA 2 μL，上、下游引物各1.5 μL，SYBR Green Supermix 12.5 μL，ddH2O 7.5 μL。反應程序如下：95℃預變性3 min，95℃變性10 s，退火30 s（溫度見表1），72℃延伸30 s，循環40次。

1.2.6 目的基因組織表達分析 設置qRT-PCR溫度梯度，以便確定最佳退火溫度和優化實驗方案，檢測HIF-1α和HIF-2α mRNA分別在牦牛和黃牛的繁殖相關組織表達差異，反應體系25 μL：酶12.5 μL，ddH2O 7.5 μL，上、下游引物各 1.5 μL，cDNA 2 μL，反應程序和1.2.5一致。每個樣品作3個重復。熒光定量結果分析方法參照［12］。

1.2.7 數據分析 數據用SPSS 22.0軟件進行顯著性分析，結果用“平均值±標準誤（Mean±SE）表示，采用One-way ANOVA和t-檢驗進行差異顯著性分析。

2 結果

2.1 牦牛和黃牛不同組織總RNA提取

提取的RNA經過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，在凝膠成像系統下觀察，28S RNA和18S RNA條帶清晰可見。說明提取的總RNA完整性強，無降解；分光光度計測得樣品OD260/ OD280比值均在1.8-2.0之間，說明提取總RNA純度高。這兩者結果表明RNA均符合要求，可以用于后續實驗。

2.2 常規PCR檢測引物特異性

取PCR產物10 μL加入上樣孔，110 V電泳30 min，1%瓊脂糖凝膠電泳結束后，在瓊脂糖凝膠成像系統清晰觀察到在膠上173 bp和140 bp處均為單一條帶，說明引物的特異性好且與預期的片段長度相符。將測序結果與NCBI公布的序列進行比對，結果（圖1）表明，這6段序列與NCBI公布序列完全一致?？梢杂糜趯嶒灪罄m工作。

圖1 HIF-1α、HIF-2α和GAPDH基因在黃牛和牦牛擴增產物

2.3 RT-qPCR檢測目的基因和內參基因的擴增效率

以制備好的標準品作為模板，RT-qPCR自動生成HIF-1α、HIF-2α和GAPDH基因的標準曲線和熔解曲線。由標準曲線可知R2值（相關系數）均大于或等于0.998，計算擴增效率［12］分別為2.02、1.98和1.98，滿足實驗要求；優化RT-qPCR后，各基因溶解曲線形成單峰（圖2），表明符合RT-qPCR要求。可以用于實驗后續工作。

2.4 目的基因組織表達量分析

RT-qPCR檢測結果表明HIF-1αmRNA、HIF-2αmRNA在牦牛生殖軸均有表達，但在各個組織中存在較大差異。HIF-1αmRNA在牦牛輸卵管表達量最高，在下丘腦、腦垂體、卵巢和子宮相對表達量較低。HIF-1αmRNA在牦牛腦垂體、輸卵管表達量均極顯著高于黃牛（P＜0.01），而兩物種在下丘腦、子宮和卵巢的表達差異均不顯著（圖3）。HIF-2αmRNA在牦牛腦垂體表達量最高。HIF-2αmRNA在牦牛腦垂體表達量極顯著高于黃牛（P＜0.01），在輸卵管表達量顯著高于黃牛（P＜0.05），而兩物種在下丘腦、卵巢和子宮的表達差異均不顯著（圖4）。

圖2 HIF-1α、HIF-2α和GAPDH溶解曲線

圖3 HIF-1α mRNA在黃牛和牦牛不同組織的表達量

圖4 HIF-2α mRNA在黃牛和牦牛組織表達譜

3 討論

HIF是誘導低氧基因和修復細胞氧內環境的核心調節因子，通過增強轉錄水平參與缺氧反應基因的調控，從而使機體對低氧刺激產生復雜反應。HIF-1α 主要作為應激性低氧調控因子來調節細胞活動，HIF-2α主要負責細胞的長期性低氧適應［13］。HIF能夠提高滋養細胞的耐氧能力，而滋養細胞利于侵襲子宮蛻膜［14］。HIF-1α與胎盤轉錄因子相關，胚胎在子宮內膜處于生理性缺氧狀態時，HIF對于胚胎發育期間的造血前體細胞增殖和存活，低氧條件下對滋養細胞增殖及其在子宮著床有重要的調控作用［15］。然而，有研究表明在極度缺氧的狀況下，HIF-1α等分子的作用不足以緩沖低氧的損害，使滋養細胞出現嚴重缺氧、微管骨架結構改變和侵襲能力明顯下降，使侵襲子宮蛻膜層過淺，對滋養層細胞有明顯的抑制作用［16］。在高海拔低氧條件下，高原綿羊黃體中HIF-1α和VEGF基因的表達量顯著升高，增加黃體血管分布，提高黃體功能，從而提高對低氧條件的適應能力［17］。對牛的初始黃體和黃體顆粒細胞的研究證明，HIF通過PKA信號途徑調節黃體細胞的增殖和固醇類激素的生成［18］，以提高對高原低氧的適應能力。但有研究表明長時間生活在高海拔低氧的動的繁殖能力都降低［7，17，19］。雌性動物生殖活動受到下丘腦-垂體-卵巢軸（Hypothalamus-pituitary-ovaries，HPO）調控，輸卵管是受精和早期卵裂的場所，而子宮是胚胎和胎兒發育的場所，因此，本研究采用RT-qPCR法檢測了HIF-1αmRNA和HIF-2αmRNA在高海拔低氧環境條件下生存的牦牛與低海拔條件下生存的黃牛的HPO、輸卵管和子宮組織的表達量差異，對揭示母牦牛生殖機能對高原低氧環境適應的分子調控機制具有重要意義。

本實驗表明，HIF-1αmRNA在牦牛和黃牛下丘腦、腦垂體、輸卵管、卵巢和子宮中都有表達說明該基因無組織表達特異性［20］，同時HIF-2αmRNA在牦牛卵巢表達，但這與Xiong等［21］研究認為該基因在卵巢中無表達研究結果不一致，推測可能是實驗方法不同引起結果不同，也說明兩基因對調節動物繁殖機能有不可忽略的作用。HIF-1αmRNA在牦牛輸卵管表達量最高，輸卵管是哺乳動物受精和早期胚胎發育的場所，推測牦牛輸卵管對低氧應激敏感性極高。下丘腦和腦垂體影響動物FSH（卵泡刺激素）和LH（促黃體素）的分泌，對動物生殖活動有重要的調節作用，有研究證明該基因在動物處于低氧狀態下會誘導產生FSH，促進卵泡在低氧環境中成熟［22］，本實驗結果表明，HIF-1αmRNA在牦牛腦垂體表達量極顯著高于黃牛（P＜0.01）且在牦牛下丘腦表達量最低，推測在牦牛處于低氧環境中，該基因可能引起牦牛較低的繁殖力。HIF-2αmRNA在牦牛腦垂體表達量極顯著高于黃牛（P＜0.01），表明低氧環境可能通過刺激牦牛腦垂體分泌相關激素調節促紅細胞生成素的合成和分泌，同時也會影響繁殖機能［23-25］。HIF-1α、HIF-2αmRNA 在牦牛的表達量均高于黃牛，而HIF對促性腺激素釋放激素、雌激素和促黃體素等生殖激素有促進作用［26］，推測低氧誘導因子在牦牛處于低氧環境中對維持牦牛繁殖性能和調控牦牛繁殖相關激素有重要作用［26］。HIF-2α會參與促紅細胞生成素的合成［23-25］，而該生成素會影響輸卵管中包括雌激素等多種激素的分泌［27］，本實驗中HIF-2αmRNA在輸卵管表達量顯著高于黃牛（P＜0.05），推測該基因會通過促紅細胞生成素調控牦牛生殖激素的分泌，影響牦牛生殖活動，然而，動物長期的HIF高水平對其生殖能力有不良影響［4］。另外，HIF-1α、HIF-2αmRNA 表達量均高于牦牛，說明HIF在缺氧的狀態下會比非缺氧狀態下更加活躍［28］，而這種活躍程度是否會造成兩物種的繁殖差異可做進一步研究。另外，本研究發現HIF-1α、HIF-2αmRNA在季節性發情的母牦牛與全年發情的黃牛在下丘腦、卵巢和子宮的表達差異均不顯著，然而，本實驗的牦牛樣品均采自發情季節，因此，兩基因在牦牛季節性乏情期與發情季節的表達量差異可做進一步研究。

4 結論

長期處于低氧環境下的牦牛的腦垂體和輸卵管中HIF-1α、HIF-2αmRNA表達量高于黃牛，這可能是牦牛生殖機能對高原低氧環境適應的重要調控機制。