乙二醇對體內外源基因表達的作用研究

王棋文 李盼 潘翠云 韓芬霞

（1. 河南師范大學生命科學學院 省部共建細胞分化調控國家重點實驗室培育基地，新鄉 453007；2. 河南科技學院動物科技學院，新鄉 453003）

尾靜脈液壓轉基因技術（Hydrodynamics-based transgene，HDT），又稱尾靜脈大容量快速基因注射法（Hight capacity and quick injection，HQI），其原理是短時間內大量溶液從尾靜脈運輸到動脈時，導致大量溶液在下腔靜脈聚積，產生很高的靜脈壓使肝門靜脈打開，大量血液流入肝門靜脈，致使肝竇孔徑增大，肝細胞產生穿孔，膜透性增加，外源大分子進入肝細胞，以此達到基因瞬時轉染的目的［1］。液壓轉基因技術具有操作簡單、靶向性強、安全性好、轉染率高、對轉基因動物的生理功能無影響等優點。液壓轉基因技術已是一項成熟的技術，基于液壓轉基因的優點，此項技術已被廣泛應用。例如，Hubner等［2］利用液壓轉基因技術對小鼠肝細胞進行遺傳體內修飾的組成型和誘導型系統研究。Yamazaki等［3］基于液壓轉基因技術對小鼠尾靜脈注射編碼中和mAbs（Monoclonal antibodies）的質粒，其對致死性流感病毒感染具有治療作用。然而該技術只能達到基因的瞬時轉染，因此探索保持外源基因持續穩定表達的方法有著重要的意義。

乙二醇（Ethylene glycol，EG）是最簡單的二醇，與甘氨酸分子構型相似，能調節甘氨酸核糖開關的終止子穩定性和適配子從屬性，影響基因的轉錄［4］；液態乙二醇還能維持納米粒子表面熒光強烈和穩定的發射［5］；乙二醇的高聚物聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）是一種相轉移催化劑，可以用于純化質粒，也用于細胞融合；聚乙二醇通過質粒表面的聚乙二醇化和內部疏水作用增強了質粒 DNA 超螺旋結構穩定［6］。乙二醇也是一種有毒化合物，攝入后引起嚙齒動物肝重增加、肝脂肪變性、透明氣球樣變和肝中心小葉退行性變。但目前對于在液壓轉基因中乙二醇對肝臟的作用和外源基因表達的影響尚未有研究，因此本研究用乙二醇和外源質粒pEGFP-C1 共同進行尾靜脈液壓轉基因后，檢測肝臟損傷情況和綠色熒光蛋白表達率，探索液壓轉基因中乙二醇對小鼠肝臟外源基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性小鼠，體重約 23±2 g，由河南師范大學實驗動物中心提供；表達質粒 pEGFP-C1（購自美國BD Biosciences Clontech公司，綠色熒光蛋白的啟動子來自巨細胞病毒，Cytomegalovirus，CMV）；乙二醇（分子量 62.07，河南焦作市化工三廠）；冰凍切片機（德國，Leica，CM1850）；熒光顯微鏡（日本，Nikon，ECLIPSE 80i）。

1.2 方法

1.2.1 質粒制備 將購買的表達質粒 pEGFP-C1 轉化大腸桿菌 DH5α感受態細胞，涂布LB 固體培養基平板（含 100 μg/mL氨芐青霉素），37℃ 溫箱中倒置培養過夜，挑選出含質粒 pEGFP-C1 的陽性菌株。將含質粒 pEGFP-C1 的陽性菌株接種到10 mL含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養液中，37℃震蕩培養過夜。取少量上述菌液（約1-2 mL）接種到200 mL LB培養液中，37℃震蕩培養過夜。低溫離心收集菌體，NaOH-SDS堿裂解法裂解菌體，用酚/氯仿/異戊醇進行抽提，PEG-NaCl 沉淀法純化質粒，純化的質粒用生理鹽水溶解。核酸蛋白含量測定儀測定質粒濃度與純度，260 nm/280 nm吸光值比值在1.8-2.0之間，且瓊脂糖凝膠電泳檢測無基因組DNA和RNA時合格備用。

1.2.2 小鼠肝臟液壓轉基因 乙醚麻醉小鼠后，酒精棉球擦拭小鼠尾部，將無菌注射器針頭在小鼠尾1/3處刺入靜脈，快速均勻的將pEGFP-C1質粒溶液注入尾靜脈，注射完后，用脫脂棉按住針眼處止血，最后在針眼處涂抹紅霉素軟膏以防止感染。

1.2.3 小鼠肝臟形態結構觀察和綠色熒光蛋白基因表達情況檢測 小鼠尾靜脈液壓轉基因后24 h、48 h和72 h時頸椎脫臼處死小鼠，取出肝葉液氮速凍10-15 s后，冰凍切片機內平衡30 min，制備7 μm冷凍切片。（1）將冷凍切片進行蘇木素染色3-5 min，細水沖洗后酒精鹽酸分色，自來水返藍10-15 min，甘油封片，觀察小鼠肝臟損傷；（2）在波長488 nm的熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）表達量，并隨機選取3個不重疊的視野（10×）拍照，分別統計綠色熒光蛋白陽性細胞和DAPI復染的細胞核數目，計算陽性細胞占總細胞數的比率，計算轉染率。

2 結果

2.1 液壓轉基因的條件

依據本實驗室之前所建立的小鼠液壓轉基因條件［7］：注射速度0.8 mL/s，質粒溶液注射量為小鼠體重的10%，質粒濃度30 μg /mL將質粒溶液均速注射到小鼠尾靜脈中。

2.2 液壓轉基因后綠色熒光蛋白在小鼠肝內表達變化

按照結果2.1液壓轉基因的條件進行小鼠尾靜脈注射pEGFP-C1質粒，分別在尾靜脈注射后6 h、24 h、48 h、72 h取小鼠肝右葉觀察質粒轉染情況，并計數綠色熒光蛋白陽性細胞比率。結果（圖1）表明，轉基因后，小鼠肝臟發白膨脹，肝索紊亂，細胞間隙變大，并發現血管壁破裂現象，但隨著恢復時間增加，癥狀減弱基本恢復正常。在轉基因后6 h綠色熒光蛋白陽性細胞占2.22%，24 h陽性細胞比率最高為14.00%，48 h為3.11%，72 h為1.33%。

圖1 小鼠尾靜脈液壓轉基因后綠色熒光蛋白基因在肝內的表達變化

2.3 乙二醇與液壓轉基因共同作用時小鼠肝臟的變化

2.3.1 液壓轉基因后24 h小鼠肝內綠色熒光蛋白表達變化及肝臟損傷情況 分別配制含0.05 mol/L、0.1 mol/L、0.25 mol/L和0.5 mol/L乙二醇的 pEGFP-C1（30 μg/mL）質粒溶液，按照結果2.1液壓轉基因條件進行小鼠尾靜脈注射，在尾靜脈注射后 24 h取小鼠肝臟右葉觀察轉染率和肝臟損傷情況，結果（圖2）表明，隨著乙二醇濃度增加，肝臟損傷程度較重，出現大小不一，數量不等的空泡結構。統計綠色熒光蛋白陽性細胞率表明（圖3），乙二醇濃度為 0.05 mol/L時占 7.43%，0.1 mol/L時占3.96%，0.25 mol/L占3.72%，0.5 mol/L占1.93%。

圖2 乙二醇作用下液壓轉基因后24 h時小鼠肝臟組織結構觀察

圖3 乙二醇-液壓轉基因24 h后綠色熒光蛋白基因在小鼠肝臟內的表達變化

2.3.2 液壓轉基因后72 h小鼠肝內綠色熒光蛋白表達變化及肝臟損傷情況 液壓轉基因后72 h取小鼠肝臟右葉觀察轉染率和肝臟損傷情況，結果（圖4）表明，小鼠肝臟損傷程度減弱，逐漸恢復，空泡結構減少，但細胞間隙仍比較大。統計綠色熒光蛋白陽性細胞率（圖5）表明，乙二醇濃度為0.05 mol/L時 占3.78%，0.1 mol/L時 占 9.67%，0.25 mol/L占10.11%，0.5 mol/L占15.96%。

圖4 乙二醇作用下液壓轉基因后72 h小鼠肝臟組織結構觀察

3 討論

尾靜脈液壓轉基因技術（Hydrodynamics-based transgene，HDT）是一種有效地成體體內轉基因方法，用于多種基因功能分析［8］、甘露聚糖結合凝集素介導的基因轉移、RNA 干擾研究［9］、基因治療［10］等研究。本實驗室過去對大鼠肝臟進行液壓轉基因研究表明，將大鼠體重9%的質粒溶液（質粒濃度為30 μg/mL），以2 mL/s的速度進行大鼠尾靜脈注射，轉基因后約6 h綠色熒光蛋白達到較高表達率［11］。在此基礎上，我們以小鼠為實驗材料進行液壓轉基因研究，將小鼠體重10%的質粒溶液（質粒濃度30 μg/mL），以0.8 mL/s的速度進行小鼠尾靜脈注射，轉基因后約24 h綠色熒光蛋白達到較高表達率。

乙二醇是一種無色透明，揮發性低，無臭有甜味的黏稠液體，易溶于水等極性溶劑，是合成纖維、制造樹脂的主要原材料，并能用于多種化工生產。乙二醇具有一定的毒性［12］，屬低毒性化學物，但其代謝產物毒性較高。朱士勝等［13］研究發現SD大鼠急性乙二醇中毒后肝臟細胞發生壞死。乙二醇的聚合物聚乙二醇能夠修飾一些藥物進而改善藥性，例如鄭麗麗等［14］對聚乙二醇修飾甲硫氨酸腦啡肽靜脈注射時對熱板致痛小鼠的鎮痛作用研究發現聚乙二醇能夠修飾甲硫氨酸腦啡肽，然后靜脈注射到小鼠體內時發現適當相對分子質量聚乙二醇修飾甲硫氨酸腦啡肽可提高鎮痛強度和藥效維持時間，對改善其成藥性具有積極意義。少量的攝入乙二醇后，能迅速分布于血液和組織液中，隨著血液循環輸送到不同組織器官，在肝臟乙醇脫氫酶（Alcohol dehydrogenase，ADH）或其他肝酶催化下代謝生成羥乙醛、乙醇酸（Glycolic acid，GA）和乙醛酸［15］。隨后，乙醛酸轉化為草酸，草酸與鈣形成草酸鈣晶體，在腎臟和其他組織內沉淀，會對動物內臟器官有一定的損傷［16］。這并不能否認乙二醇具有一定的生物學作用。

本實驗按照上述小鼠液壓轉基因條件進行乙二醇與質粒同時尾靜脈注射，發現乙二醇濃度在0.05 mol/L-0.5 mol/L 范圍內，轉基因后24 h時隨著乙二醇濃度升高，綠色熒光蛋白陽性細胞率呈降低趨勢；72 h時陽性細胞率隨著乙二醇濃度升高而升高，且在72 h乙二醇濃度為 0.5 mol/L 時陽性細胞率較高。這一現象可能有兩個原因，一是隨著乙二醇濃度升高，小鼠肝臟損傷程度增大，24 h時肝臟損傷尚未恢復，致使綠色熒光蛋白基因在肝細胞中的表達量越低；而且隨著恢復時間推移，肝臟逐漸恢復正常，進入肝細胞的質粒恢復正常表達；乙二醇濃度為 0.5 mol/L 時轉基因后72 h陽性細胞率較高，可能是因為乙二醇濃度較高，對肝細胞毒性較大，增大了肝細胞的膜透性，液壓轉基因時進入肝細胞的質粒較多。二是乙二醇可能提高質粒超螺旋結構的穩定性。在乙二醇存在時，pEGFP-C1質粒不能解超螺旋轉錄表達，因此 24 h時綠色熒光蛋白表達量較低，隨著肝臟恢復，乙二醇被消耗，pEGFP-C1 質粒恢復轉錄表達。

4 結論

本研究利用液壓轉基因技術將含有乙二醇的pEGFP-C1質粒注射小鼠尾靜脈中，檢測對肝臟外源基因表達的影響。結果表明，乙二醇在液壓轉基因中能調節外源基因的表達，使外源基因表達高峰向后推移，但具體作用機制還不甚清楚。該研究為研究乙二醇對肝再生的影響及探索乙二醇的其他生物學作用奠定了基礎。