蘇云金芽胞桿菌Vip3AaAdAa嵌合蛋白的構建及其殺蟲活性分析

于爽 李帥 李海濤 劉榮梅 高繼國

（1. 東北農業大學生命科學學院，哈爾濱 150030；2. 牡丹江師范學院生命科學與技術學院，牡丹江 157011）

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，簡稱Bt）是革蘭氏陽性菌，其在生長代謝過程中可以產生分泌到胞外的營養期殺蟲蛋白（Vegetative insecticidal proteins，簡稱 VIPs）［1］和分泌型殺蟲蛋 白（Secreted insecticidal protein， 簡 稱 SIPs）［2］，母細胞在釋放芽胞時也可以產生殺蟲晶體蛋白（Insecticidal crystal proteins，簡稱ICPs）。殺蟲晶體蛋白主要分為Cry 和Cyt 兩類，圍繞Bt Cry 殺蟲晶體蛋白的研究非常廣泛，包括含有新cry基因菌株的發掘、cry基因的轉錄調控機制、Cry 蛋白的結構與功能及Cry 蛋白在田間應用的問題等［3］。隨著Cry蛋白在微生物工程菌和轉基因抗蟲植物中的廣泛應用，導致一些昆蟲對Cry蛋白產生耐藥性及抗性［4-5］。

營養期殺蟲蛋白在氨基酸序列的進化上與Cry蛋白沒有同源性，且殺蟲位點與Cry蛋白也沒有競爭關系［6-7］。Vips作為第二代生物殺蟲劑對鱗翅目和雙翅目具有廣譜性，可以單獨或與Cry蛋白結合來預防或延緩昆蟲抗性的產生，擴大殺蟲譜［8-10］，是害蟲治理的新策略［11］。

目前已經公布的vip基因根據它們的序列相似性分為四類，分別是vip1、vip2、vip3和vip4，其中vip3的研究較為深入［10，12］。Bt毒素委員會記載的有65 個vip3Aa，2 個vip3Ab，1 個vip3Ac，6 個vip3Ad，1 個vip3Ae，4 個vip3Af，15 個vip3Ag，2 個vip3Ah，1 個vip3Ai，2個vip3Ba，3個vip3Bb和 4 個vip3Ca（http：//www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html）。已有研究發現通過基因工程技術改造已有的抗蟲基因可以改變蛋白的殺蟲活性或蛋白殺蟲譜［13-14］。人工交換Cry1Ab和Cry1C的DomainⅢ構建了一個新的Cry蛋白（1Ab-1Ab-1C），該蛋白對甜菜夜蛾幼蟲的殺蟲活性比單純Cry1Ab和Cry1C殺蟲活性高出十倍以上［15］。而Cry1Ab、Cry1Ah 的結構域交換后與出發蛋白相比，雜合蛋白 AhAhAb 喪失了對棉鈴蟲殺蟲活性，降低了對玉米螟、小菜蛾殺蟲活性。將Cry3Aa的DomainⅠ和Ⅱ與Cry1Ab的DomainⅢ嵌合獲得的新蛋白能夠對玉米根螢葉甲產生毒殺作用，而Cry3Aa和Cry1Ab對其沒有活性［16］。而對vip的基因改造研究較少。

Vip3Aa蛋白對棉鈴蟲、甜菜夜蛾、斜紋夜蛾等鱗翅目昆蟲具有較強的殺蟲活性［17］。Vip3Ad 對許多害蟲沒有殺蟲活性［18］。本研究利用重疊PCR的方法，通過比較Vip3Aa39與Vip3Ad蛋白的功能域，構建了三種vip3AaAdAa型嵌合基因，將其轉入大腸桿菌中表達嵌合蛋白，并測定了其對甜菜夜蛾的殺蟲活性。旨在為深入了解Vip3A殺蟲蛋白關鍵活性區域，進一步揭示 Vip3A的殺蟲機理提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 分別攜帶vip3Aa39和vip3Ad基因的pET21b質粒、E. coliBL21感受態細胞、表達載體pET21b由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 膠回收試劑盒與質粒提取試劑盒購自美國 Axygen 公司，酶類購自TaKaRa公司，其它試劑為進口或國產分析純。引物合成及基因克隆測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.1.3 培養基 LB液體培養基：Yeast extract 0.5%，NaCl 1%，Tryptone 1%，pH調為7.0。LB固體培養基：在LB液體培養基中按1.3%的比例加入瓊脂，121℃濕熱滅菌20 min。

1.1.4 供試昆蟲 甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）蟲卵均購自河南省濟源白云實業有限公司。待其產卵后，置于鋪有吸水紙的塑料盒中，人工氣候箱保持相對濕度在60%，溫度30℃，待其孵化，初孵幼蟲供生物測定使用。

1.2 方法

1.2.1 嵌合基因片段的克隆Vip3AaAdAa基因是由vip3Aa39提供前段、后段序列，vip3Ad提供部分中間序列，拼接得到的嵌合基因。通過比對Vip3Aa39與Vip3Ad氨基酸序列，選取部分保守區域，設計了5對中間引物（JB2F、JB2R、JB3F、JB3R、JB4F、JB4R、JB5F、JB5R、JB6F和JB6R）及2對全長引物（39F、39R和DF、DR），在全長引物中分別加入了BamHI和SalI酶切位點（下劃線），見表1。參考重疊延伸PCR法進行片段的互換［19］，用KOD高保真酶進行擴增，回收PCR產物，將重組基因與pET21b質粒分別雙酶切后4℃連接過夜，將重組質粒轉入BL21感受態，挑取陽性克隆子送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，使用NCBI數據庫和DNAMAN軟件對結果進行分析比對。

以嵌合基因vip3AaAdAa1的構建為例，先以本實驗室保存的pET-Vip3Aa39質粒為模板，引物39F/JB2R、JB3F/39R 進行 PCR 擴增，得到vip3Aa39的0-354、810-2370序列片段vaq1、vah1；繼續以pET- Vip3Ad質粒為模板，用引物 DF /JB3R 進行 PCR 擴增，得到vip3Ad的0-810序列片段vDq1；切膠純化后的產物vah1、vDq1為模板，通過引物 DF/39R 進行融合擴增，得到vipD391基因；以vipD391基因為模板，JB2F/39R為引物，擴增得到vDM391；最后以vaq1和vDM391為模板，用引物 39F /39R 進行 PCR 擴增，得到的嵌合基因即為vip3AaAdAa1。vip3AaAdAa2、vip3AaAdAa3的構建見圖1和表2。

表1 PCR擴增引物序列

圖1 嵌合基因的構建

1.2.2 嵌合蛋白的表達 將3個含有嵌合基因的重組質粒以及pET-Vip3Aa39和pET-Vip3Ad質粒轉化到大腸桿菌 BL21（DE3）菌株的感受態細胞后進行誘導IPTG表達蛋白，收集誘導物，離心，棄上清，用20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）緩沖液懸浮細胞并進行超聲波破碎，取樣進行SDS-PAGE分析［20］。

1.2.3 甜菜夜蛾的生物活性測定 將粗提蛋白用20 mmol/L Tris-HCl稀釋成不同的濃度，且取3.0 mL待測樣品溶液加入到30 g飼料中混勻，室溫晾置蒸發多余水分；分裝于已消毒的24孔細胞培養板中；將初孵幼蟲接于24孔板中，每孔一頭；放置在27℃的人工氣候箱中培養，光周期為14∶10，濕度控制在65%左右。培養7 d后分別調查死、活蟲數，計算死亡率。

表2 嵌合基因合成模板與引物

1.2.4 胰蛋白酶消化 將3個嵌合蛋白與Vip3Aa39與Vip3Ad蛋白用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液定量到300 μg/mL。為確定嵌合蛋白的消化時間，先對Vip3Aa39與Vip3Ad蛋白進行不同時間下的胰蛋白酶（0.1 mg/mL）處理，按胰蛋白酶與定量后蛋白1∶10的比例加入1.5 mL EP管中。快速混勻后加入37℃水浴鍋中溫育。在溫育5 min后，快速加入上樣緩沖液，沸水下變性10 min。然后進行SDSPAGE電泳。

2 結果

2.1 嵌合基因的獲取

用KOD高保真酶進行擴增，回收PCR產物，將重組基因與pET21b質粒分別雙酶切后連接過夜，將重組質粒轉入BL21感受態，挑取陽性克隆子送測序，使用NCBI數據庫和DNAMAN軟件對結果進行分析比對證明插入片段大小正確，長度為2 370 bp（圖 2）。

圖2 3種嵌合基因與初始基因的PCR鑒定

2.2 嵌合蛋白的SDS-PAGE分析

將3個含有嵌合基因的重組質粒以及pETVip3Aa39和pET-Vip3Ad質粒轉化到大腸桿菌 BL21（DE3）菌株的感受態細胞后進行誘導表達蛋白。SDS-PAGE 結果（圖3）表明，在經 IPTG 誘導后的表達產物在分子量約為 88 kD 處有明顯的特異性表達條帶，與理論推算基本相符。

圖3 3種嵌合基因和初始基因在BL21中的蛋白表達

2.3 5種蛋白對甜菜夜蛾的殺蟲活性

將Vip3Aa39、Vip3Ad和3種嵌合蛋白對甜菜夜蛾初孵幼蟲進行生物活性測定，校正死亡率如表3。Vip3Aa39和3種嵌合蛋白對甜菜夜蛾具有較高的殺蟲活性，而Vip3Ad對甜菜夜蛾沒有活性；嵌合蛋白Vip3AaAdAa1和Vip3AaAdAa3的校正死亡率均低于Vip3Aa39，且差異顯著，其中Vip3AaAdAa1蛋白的校正死亡率比Vip3Aa39低76.9%，Vip3AaAdAa3蛋白的校正死亡率比Vip3Aa39低51.3%，而Vip3Aa-AdAa2蛋白與Vip3Aa39校正死亡率差異不顯著。

表3 5種蛋白對甜菜夜蛾的生物活性（7 d）

通過蛋白對甜菜夜蛾致死中濃度LC50的測定表明（表 4），Vip3Aa39、Vip3AaAdAa1和 Vip3AaAd-Aa3對甜菜夜蛾具有比較高的殺蟲活性，Vip3AaAd-Aa1蛋白的LC508.227μg/mL，比Vip3Aa39的LC50升高了2.7倍；Vip3AaAdAa3蛋白的LC505.452 μg/mL，比Vip3Aa39升高了1.4倍，且差異顯著，可見嵌合蛋白Vip3AaAdAa1和Vip3AaAdAa3的殺蟲活性均低于Vip3Aa39；而Vip3AaAdAa2蛋白的活性與Vip3Aa39差異不顯著。

2.4 胰蛋白酶敏感性分析

將3個嵌合蛋白用胰蛋白酶處理5 min發現，88 kD的蛋白條帶消化后均得到62 kD的消化條帶（圖 4）。

表4 4種蛋白對甜菜夜蛾的致死中濃度

圖4 胰蛋白酶處理后的嵌合蛋白和初始蛋白SDS-PAGE圖

3 討論

蘇云金芽胞桿菌營養期殺蟲蛋白已被用于作物保護和延緩對現有殺蟲性Cry毒素的抗性。然而，人們對Vip3A的行為或作用機制知之甚少，也不清楚其結構模型［21］。近年來發現，C末端缺失154個氨基酸可使Vip3A蛋白失去對甜菜夜蛾和斜紋夜蛾的殺蟲活性，而對玉米螟的殺蟲活性僅僅稍有降低［22］。Vip3A蛋白由～789個氨基酸組成，Vip3Ad與Vip3Aa39的氨基酸相似性為85%，差異性較大的部分集中在后半段。

本研究通過這兩個蛋白的結構互換獲得了3個嵌合蛋白，并對甜菜夜蛾進行抗蟲性分析，結果表明，將Vip3Aa39的118-210氨基酸片段用Vip3Ad的對應片段替換后殺蟲活性明顯下降，嵌合蛋白Vip3AaAdAa1與Vip3Aa39相比僅有3個氨基酸差異，用纈氨酸（V）替代了134位的丙氨酸（A），用甲硫氨酸（M）替代了176位的異亮氨酸（I），用脯氨酸（P）替代了201位的絲氨酸（S）；將Vip3Aa39的210-345氨基酸片段用Vip3Ad的對應片段替換后殺蟲活性與Vip3Aa39相比無明顯差異，Vip3AaAdAa2與Vip3Aa39相比也有3個氨基酸差異位點，用天冬酰胺（N）替代了338位的纈氨酸（V）和342位的天冬氨酸（D），用蘇氨酸（T）替代了345位的丙氨酸（A）；Vip3AaAdAa3是將Vip3Aa39的455-632氨基酸片段用Vip3Ad的對應片段替換，互換后有36個氨基酸位點發生改變，殺蟲活性與Vip3Aa39相比下降了1.4倍。3個嵌合蛋白的殺蟲活性與Vip3Aa39相比有所改變，證明新的序列插入改變了殺蟲活性，活性改變的原因還需要繼續研究。

在敏感昆蟲腸液或Trypsin的作用下Vip3A蛋白能水解成分子量分別為62、45、33及22 kD的4條主帶，其中62 kD片段能與甜菜夜蛾的刷狀緣膜細胞（BBMV）相結合，形成離子孔道進行穿孔，誘發靶標昆蟲細胞凋亡，細胞核溶解，導致昆蟲死亡［23］。研究表明，3種嵌合蛋白和Vip3Aa、Vip3Ad均表達88 kD的蛋白，經胰蛋白酶消化后均出現62 kD的蛋白條帶。62-66 kD的片段是Vip3Aa蛋白的活性中心。Vip3A蛋白既可被敏感昆蟲的中腸液消化產生蛋白片段，同樣也可被不敏感昆蟲的中腸液消化產生同樣的蛋白條帶，但是活化后的Vip3A蛋白對非敏感昆蟲依然沒有毒性［24］。這說明活化只是Vip3A毒素發揮作用的開始，后續還有很復雜的過程。

4 結論

利用重疊PCR的方法，通過比較對甜菜夜蛾具有高活性的Vip3Aa與無殺蟲活性Vip3Ad蛋白的功能域，成功構建了3種vip3AaAdAa型嵌合基因，將其轉入大腸桿菌中表達嵌合蛋白。結果顯示，嵌合蛋白Vip3AaAdAa1和Vip3AaAdAa3對甜菜夜蛾具有比較高的殺蟲活性，Vip3AaAdAa3蛋白的LC50值比Vip3Aa39增加了1.4倍，而Vip3AaAdAa1蛋白的LC50值比Vip3Aa39增加了2.7倍，導致嵌合蛋白Vip3AaAdAa1和Vip3AaAdAa3的殺蟲活性均低于Vip3Aa39；Vip3AaAdAa2的殺蟲活性與Vip3Aa39差異不顯著。