海洋源乳酸菌AI-2類群體感應抑制劑對單增李斯特菌抑制效果研究

黃湘湄 吳雅茜 劉穎 梁嘉燁 蘇偉明

（廣東省水產品加工與安全重點實驗室 廣東海洋大學食品科技學院，湛江 524088）

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes，L. m）因含有內化素、李斯特菌溶血素、蛋白ActA、磷酸脂酶C等毒力因子，極易引發高的致死率（高達20%）［1］，同時，形成的生物被膜（Biofoilm，BF）加劇了L. m對不良外界環境因素的耐受力［2-3］，可在酸性、堿性及低溫條件下生長，而且L. m生活范圍非常廣泛，因此對各類食品的安全構成極大的威脅。自美國甜瓜污染L. m造成33人死亡的食源性感染［4］，至死亡率達15%的27個歐盟成員國報告的2161例L. m污染食品等災難性事件的爆發［5］，已引起各國政府的高度關注，并被WTO世界衛生組織定義為四大食源性致病菌之一［6］。

越來越多的研究顯示，L. m毒力及生物被膜的形成等致病力相關的生物現象是受細菌群體感應系統（Quorum-Sensing，QS）自誘導物質（Autoinducer，AI）的信號分子調控的［7-8］。信號分子AI能夠感應細菌種群密度及周圍環境的變化，當信號分子AI-2濃度達到一定閾值時，可以結合細胞膜上的受體并通過信號傳遞系統調控如毒力等特定基因表達［9］，因此，通過阻斷信號分子AI-2的傳遞成為控制L.m等致病菌的一個有效策略。而群體感應抑制劑（Quorum sensing inhibitor，QSIs）可以阻斷細菌種內或種間信號分子的形成與交流，使致病細菌及腐敗細菌的致病能力與致腐能力下降［10］，也使得尋找新型、有效的QSIs成為研究熱點。目前，科學家通過對海洋生物的研究發現了許多具有QS系統活性的抑制劑，如海洋紅藻（Delisea pulchra）［11-14］、萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtiij）［15］分泌產生的鹵代呋喃酮等多種化合物，與細菌AI-2類QS信號分子結構類似，通過與信號分子受體蛋白競爭性結合抑制細菌QS調控的多種功能。海洋微生物在物種、生態、遺傳等方面都呈現豐富的多樣性［16］，其中海洋微生物代謝產物由于化學結構的多樣性成為篩選、開發新型QSIs潛在的重要資源寶庫［17-18］。

本研究以測定報告菌哈維氏弧菌BB170的發光值作為篩選指標，對具有抗菌活性的16株海洋源乳酸菌代謝產物進行L. mAI-2信號分子QSIs的篩選，并對控制L. m的效果進行評價，研究旨在為從海洋環境中篩選與開發乳酸菌源L. mQSIs提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

單增李斯特菌標準株ATCC 19111購于廣東省微生物研究所，哈維弧菌（Vibrio harveyi）BB170由中國農業科學院韓先干教授惠贈，乳酸菌為本實驗室從湛江海域中的海洋動物腸道分離得到的；LB培養基、MRS肉湯培養基、胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯（TSB-YE）、胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂（TSA-YE）均購置于北京陸橋技術有限責任公司。乙酸乙酯、甲醇、乙醇、PBS緩沖液、結晶紫染色液購于廣州齊云生物技術有公司。

旋轉蒸發儀N-1100D-WB，東京理化；生化培養箱 SPX-250B-Z，上海博迅醫療設備廠；立式壓力蒸汽滅菌鍋 LDZX-50KBS，上海申安醫療器械廠；超凈工作臺 SW-CJ-1F，蘇州凈化設備有限公司醫療設備廠；全自動酶標儀 Varioskan Flash，美國Thermo Scientific；智能型倒置熒光顯微鏡DMI4000B，德國leica。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌乙酸乙酯提取物的制備 將16株乳酸菌接種于MRS液體培養基活化，28℃ 140 rpm搖床培養48 h，4℃ 8 000 rpm離心10 min，0.45 μm濾膜過濾得乳酸菌發酵上清液，加等量乙酸乙酯萃取過夜，并于45℃ 120 rpm真空旋轉蒸發，收集的乙酸乙酯粗提物再溶于純水，配成濃度200 mg/mL的工作液備用。

1.2.2 乳酸菌乙酸乙酯提取物對L. mAI-2類信號分子活性的影響 將實驗室4℃斜面保存的L. mATCC 19111與哈維氏弧菌BB170分別接種于100 mL TSB和LB培養基，37℃和28℃ 120 rpm搖床培養過夜，濃度調整為108CFU/mL的菌液。分別取200 μL乳酸菌乙酸乙酯提取物工作液及50 μL的L. m菌液加到10 mL TSB培養基中，37℃振蕩培養12 h，4℃12 000 rpm離心10 min取上清與50 μL哈維氏弧菌BB170菌液加到100 mL LB培養基，28℃振蕩培養6 h，取200 μL于黑色96孔板，用多功能酶標儀生物發光模式檢測BB170發光情況。AI-2活性值為含乳酸菌乙酸乙酯提取物誘導BB170發光值與發光值的百分比值，并以無菌水代替抑制劑作為陰性對照的AI-2 活性值定為 100%［19-20］。

1.2.3 QSI對L. m的MIC值測定 采用牛津杯雙層瓊脂擴散法測定抗菌活性。以L. m為指示菌，分別向牛津杯孔中加入200 μL 濃度為125、250、500 μg/mL的QSI，超純水為空白對照組，4℃靜置擴散4 h，37℃培養24 h后，將能夠L. m抑制出現明顯增長的最低濃度定為最抑制濃度（MIC）［21］。

1.2.4 QSI對L. m生長的影響 取50 μL濃度為108CFU/mLL. m菌液接種到100 mL含QSI終濃度分別為 125、250、500、1 000 μg/mL的 TSB培養基中，以不含QSI組作為陰性對照組，TSB培養基作為調零組，37℃振蕩培養24 h，每1 h于取樣并在波長600 nm處測量吸光值，以培養時間為橫坐標，繪制不同濃度的QSI作用下L. m的生長曲線［22］。

1.2.5 QSI對L. m動力的影響 將含有0.4 %瓊脂的TSB培養基加入無菌試管，添加終濃度為125、250、500 μg/mL的QSI混勻，以不含QSI作空白對照組，凝固后用接種針將L. m垂直穿刺接種，28℃下培養48 h，觀察QSI對L. m動力的影響［22］。1.2.6 QSI對L. m生物膜形成的抑制

1.2.6.1 生物膜形成的定量檢測 將濃度為108CFU/mLL. m菌液 10 μL接種到 190 μL含 QSI終濃度分別為125、250、500 μg/mL的TSB培養基的96板孔中，以不含QSI為陰性對照組。37℃靜置培養48 h，小心棄去上層菌液，以pH7.0的PBS洗去沉淀物附著的浮游菌，棄去后再加入1%結晶紫200 μL染色，室溫放置15 min，棄去染液，蒸餾水洗孔多次后室溫干燥，每孔加入200 μL的95%乙醇，以95%乙醇作為調零組，595 nm吸光度下測定生物膜生長情況及計算抑制率［23］。

1.2.6.2 生物膜的形貌觀察 將無菌玻片置于6孔板中，并向孔中加入3 mL含QSI終濃度為125、250、500 μg/mL的 TSB培養基和 10 μLL. m菌液，以不含QSI作陰性對照組，37℃靜置培養48 h后，取出玻片，用pH7.0的PBS反復洗去玻片表面的浮游菌，使用1%結晶紫染色20 min，蒸餾水沖洗玻片，室溫下晾干，光學顯微鏡觀察生物膜的形貌［24］。

1.2.7 統計學分析 每個實驗作3個平行，取其平均值，實驗數據用x-±s 表示。采用SPSS的單因素方差分析（ANOVA）樣品的顯著性差異，檢驗水準為 α=0.05。

2 結果

2.1 L. m AI-2類群體感應抑制劑的篩選

以不含乳酸菌乙酸乙酯提取物的L. m上清液誘導BB170發光值作為100%、LB培養基為空白對照。16株乳酸菌乙酸乙酯提取物對L. mAI-2信號分子的活性均表現出一定抑制效果（圖1），抑制率從36%至98.5%，其中6株菌產生的代謝產物A-3、A-4、B-1、B-4、B-5、C-3能夠有效地抑制L. mAI-2的活性，與陰性對照相比，抑制率均超過了75%，可作為潛在的L. m的QSIs，尤其菌株Pediococcus pentosaceuszy-B-1的代謝產物B-1對L. mAI-2活性幾乎完全抑制，活性僅保留了1.5%，將其命名QSI-B-1，并進一步研究對L. m的抑制效果。

圖1 乳酸菌乙酸乙酯提取物對L. m AI-2活性的影響

2.2 QSI-B-1對L. m作用的MIC值

采用雙層牛津杯擴散法對QSI-B-1進行抗菌活性測定（圖2），發現500 μg/mL的QSI-B-1較明顯地抑制了L. m的生長，抑菌圈18 mm；250 μg/mL的QSI-B-1可觀察到較小的透明圈約10 mm，125 μg/mL與空白對照組沒有完全透明的抑菌圈，因此QSI-B-1對L. m作用的 MIC值為 250 μg/mL。125、250 μg/mL的QSI-B-1的孔能觀察到較為稀疏的L. m的生長圈。

2.3 QSI-B-1對L. m生長曲線的影響

圖2 QSI-B-1的MIC值測定

生長曲線實驗（圖3）可以表明不同濃度QSI-B-1對L. m生長的影響，1 000 μg/mL的QSI-B-1完全抑制了L. m的生長；≤500 μg/mL的QSI-B-1隨著濃度增大抑制作用加強，最大OD值變小說明降低最終生長濃度，這與2.2的抑菌圈結果一致。同時QSI-B-1能推遲L. m進入對數生長期的時間，并均于11 h進入生長穩定期。

圖3 不同濃度QSI-B-1作用下L. m生長曲線

2.4 QSI-B-1對L. m動力形成的影響

通過半固體穿刺培養實驗發現（圖4），空白對照組形成傘狀生長線，邊緣呈云霧狀，表明L. m具有運動性；在125 μg/mL的QSI-B-1作用下L. m較空白對照組形成較細小的傘狀生長線，在250 μg/mL的QSI-B-1作用下未觀察到傘狀生長，表明其抑制了L.m鞭毛的形成；濃度為500 μg/mL的QSI-B-1幾乎有效的抑制L. m的生長。

圖4 QSI-B-1對L. m動力的影響

2.5 QSI-B-1對L. m生物被膜形成的抑制

濃度為 125、250、500 μg/mL的 QSI-B-1作用L. m48 h后，生物被膜的形成量均低于陰性對照組（圖5），且隨著QSI-B-1濃度的增大，對生物被膜形成的抑制效果越明顯，抑制率分別為89.94%、66.16%、40.85%。

圖5 不同濃度QSI-B-1作用下L. m生物被膜的形成量

2.6 QSI-B-1對L. m生物被膜形貌的影響

熒光倒置顯微鏡觀察QSI-B-1作用48 h后L. m的生物被膜的形貌發現（圖6），未添加QSI-B-1的空白對照組的L. m在玻片上形成了特有的三維蘑菇狀生物被膜，結構完整致密。實驗組隨著QSI-B-1濃度的增加，形成的生物膜結構愈加疏松，500 μg/mL組幾乎不能成膜。

3 討論

圖6 不同濃度QSI-B-1對L. m生物被膜結構的影響

AI-2類群體感應抑制劑（QSIs）能夠阻斷細菌種間信息的交流，靶向抑制或干擾細菌QS功能的正常發揮，為開發新型食品病源菌控制劑提供了思路［25］。QSIs主要通過抑制信號分子的合成、促進信號分子的降解或阻斷信號分子與受體蛋白結合3條途徑來干擾細菌的QS系統［26］，其中，通過抑制信號分子的活性來篩選QSIs成為研究熱點。

QSIs可以通過人工合成，也可以從動植物及微生物中篩選獲得［27］。乳酸菌是自然界中很重要的一類抑菌活性強且抑菌譜廣的生防菌，乳酸菌在生長代謝過程中會產生很多種類的抑菌活性物質，抑制多種病原菌，是獲得QSIs的重要來源，李博［28］、顧銳［29］和蔡針華［30］等從多株乳酸菌的上清液篩選QSIs，發現乳酸菌的代謝產物作為外源化合物能夠明顯地抑制致病菌L. m信號分子的活性，是靶向干擾 QS 正常功能的 QSI［31］。

本實驗采用報告菌株哈氏弧菌BB170只對AI-2類分子發生反應并誘導其發光，且AI-2活性值的高低與發光度呈正相關［32-33］，篩選得到低濃度的乳酸菌上清液的粗提物，并從生長曲線、動力、生物被膜三個方面探究其對致病菌L. m群體感應系統的抑制效果。對致病菌動力形成的抑制實質是對其鞭毛運動的抑制，是間接控制致病菌感染與致病能力的一個途徑［34］。邢家溧等［35］發現溴化呋喃酮DF可以明顯地抑制了熒光假單胞菌的群集運動能力，繼而影響了其生物膜的形成；唐藝丹［34］等發現400 μg/mL的絲狀真菌產生的丁內酯-I是銅綠假單胞菌的QSI，且能有效地抑制其運動能力，說明多種QSIs均對致病菌的動力有抑制效果。細菌生物被膜是由QS系統在信號分子的調控下菌體自發形成的菌體、胞外蛋白和多糖的混合物，其不僅使菌體易于附著在食品加工設備等固體材料的表面，使得通過清洗手段去除菌體變得困難，而且形成的保護性被膜增強了菌體對外界不良因素的抵抗性，使菌體容易逃逸藥物的抑制作用，據統計超過60%的微生物感染是由細菌的生物被膜引起的［10］，抑制致病菌L. m的生物膜的形成能減少其抗逆性。QSI靶向干擾目標菌的QS系統，但并不是完全殺死細菌，從而有效地抑制毒力因子的產生，避免了食品使用高劑量抑菌劑帶來的耐藥性［10］及人體副作用造成的危害。本研究結果表明，海洋源乳酸菌乙酸乙酯提取物作為QSIs有望成為控制L. m感染和致病性的有力武器，研究旨在通過靶向干擾QS系統的這一策略，抑制細菌生物被膜與毒力因子的形成，從而控制其致病性，為研發新型食源性致病菌抑制劑提供了理論依據。

4 結論

本研究篩選得到6株乳酸菌的乙酸乙酯提取物為良好L. mAI-2系統的QSIs，其中菌株Pediococcus pentosaceuszy-B-1乙酸乙酯提取物QSI-B-1抑制效果最好，推遲L. m進入生長期的時間并有效降低其最終生長濃度，并抑制鞭毛的運動，間接控制了L. m的感染力和致病能力。隨著QSI-B-1濃度的增加，對L.m生物被膜形成量的抑制率越高，形成的生物被膜結構愈加疏松。