拮抗匍枝根霉的生防菌R1B的篩選鑒定和抑菌活性分析

武利勤 尚宏忠 顧海科

（1. 北京市輻射中心射線束技術教育部重點實驗室，北京 100875；2. 北京師范大學核科學與技術學院，北京 100875）

梨是我國栽培歷史久、面積大、產量高的果樹之一。據統計梨是我國第3大水果，目前全國年產量占全世界產量的75%［1］。梨果實在貯藏期間，時刻會受到病害的威脅，其中梨軟腐病主要由匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）引起［2］，主要危害梨果實，在果實傷口多、貯藏期溫度高時發生較重。高溫時，5-6 d內可使病果全部軟腐，造成巨大經濟損失。匍枝根霉可以侵染多種果蔬，引起的軟腐病已經成為一種世界性病害。

新鮮水果采后腐爛是一個全球性的問題。目前生產上常采用化學藥劑防治梨采后病害，這樣不僅造成環境污染，而且增加了農產品中農藥的殘留量，給人類健康帶來潛在危害，同時也易誘導致病菌抗藥性的產生而無法控制病害。生物防治利用物種間的拮抗作用來減少病害的發生，對人畜安全、環境兼容性好、病蟲害不易產生抗藥性，因而具有化學殺菌劑不具有的優勢，正逐步成為代替化學殺菌劑的最佳方式。獲得高效拮抗菌是生物防治的基礎。枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）是最早被報道用來防治柑橘病害的細菌［3］。隨著研究的深入，人們已篩選并報道多種對果蔬采后病害具有防治效果的拮抗菌，主要是酵母菌、芽胞桿菌、假單胞菌和木霉菌［4］。幾株微生物拮抗菌已經被授權專利并商業應用，如Aspire（Candida oleophila，USA）、Biosave（Pseudomonas syringae，USA）、“Shemer”（MetschnikowiaFructicola，Israel）等［4］。微生物拮抗菌可以產生具有高拮抗活性的廣譜抗菌物質，具有極強的抗逆能力，同時具有無毒、無殘留、無致病性、對人畜安全、環境相容性好等特點，滿足了消費者對農產品質量和安全性的要求。

本研究擬從本實驗室分離保存的來源于霍山石斛、花生及蘭州百合的65株內生菌中，篩選對梨軟腐病菌有較好拮抗活性的菌株，并對篩選得到的高活性拮抗菌，初步探討其抑菌物質，為梨軟腐病菌的防治提供生物資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株、植物材料和培養基 來自霍山石斛的內生菌 22 株，花生內生菌 25 株，蘭州百合內生菌 18 株，以及梨軟腐病菌（Rhizopus stolonifer）由本實驗室分離保存。

1.1.2 主要培養基 LB培養基：胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，氯化鈉 10 g，水 1 L，pH 值 7.4-7.6。用于細菌的培養。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：馬鈴薯 200 g、葡萄糖 20 g、瓊脂 15 g、水 1 L，pH值自然。馬鈴薯葡萄糖培養基（PDB）：馬鈴薯 200 g、葡萄糖 20 g、水 1 L，pH 值自然。用于真菌的培養。121℃滅菌 20 min。

1.2 方法

1.2.1 梨軟腐病拮抗內生菌的篩選 拮抗內生菌的篩選采用對峙培養法，直徑 8 mm 的軟腐病病菌接種在直徑 9 cm 的 PDA 平板一側，相對的一側劃線接種不同的內生菌株，兩接種點相距3-4 cm，病原菌單獨接種在 PDA 平板上做對照，均設3個重復，在25℃條件下培養，2 d后測量抑菌帶寬度。

1.2.2 菌株R1B對梨軟腐病菌菌絲生長的影響 在PDA 培養基上活化梨軟腐病菌匍枝根霉，用 8 mm的槍頭在生長 2 d的匍枝根霉邊緣打取菌餅，研碎后接種于盛有 50 mL 的 1/10 PDB 培養基中，25℃，150 r/min 培養 2 d后，加入過夜培養的R1B菌懸液，使終濃度為 1×107CFU/mL，并以單獨接種在接種在 1/10 PDB 培養基中的軟腐病菌做對照。3 個重復，在 25℃ 條件下培養后鏡檢菌絲生長狀況。

1.2.3 菌株 R1B防治梨果實軟腐病的效果測定 河北水晶梨購自市場，選取外觀整齊、無病蟲害、無外傷的果實，先用自來水沖洗干凈，然后用75%酒精棉球擦拭消毒，晾干后備用。菌株R1B 活化后，接種在盛有50 mL LB 液體培養基中的搖瓶中，30℃，150 r/min 過夜培養備用。梨軟腐病菌接種在PDA平板中培養5 d，在平板中加入無菌水刮下軟腐病菌孢子，然后利用血球計數器計算孢子數目，用無菌水將軟腐病菌孢子濃度調整到1×105spores/mL。用1 mL 槍頭在梨果實表面赤道部位對稱打兩個直徑8 mm、深度3 mm 的傷口，在傷口內分別接種30 μL 5×107CFU/mL 的 R1B菌懸液（R1B處理組）和等量無菌水（對照組），每處理8個果實，重復3 次，室溫放置1 d。然后分別在R1B處理組和對照組的傷口處接種梨軟腐病菌孢子懸液 30 μL，接種處理后放入 PE 密閉箱中在 25℃，RH ＞90%條件下培養，定時觀察并記錄結果，并計算平均發病率（%）和平均病斑直徑（mm）。利用Microsoft Excel 2010 對數據進行方差分析，并采用t測驗進行差異顯著性檢驗（P＜ 0.05）。

1.2.4 菌株R1B的鑒定 生理生化鑒定參照《常見細菌系統鑒定手冊》［5］中芽孢菌屬的鑒定方法。分子生物學鑒定：菌株R1B16S rDNA 序列擴增及測序結果分析按照武利勤等［6］的方法。R1B 基因組利用通用引物 27F 和 1492R 進行擴增，PCR 產物經純化后由北京諾賽有限公司測序。獲得的 16S rDNA 基因序列在 GenBank 中進行 BLAST 比對，用 Clustal X 軟件進行序列相似性分析，采用 MEGA 5 軟件以Neighbor-joining 方法構建系統發育樹，用 Bootstrap（1 000 次重復）進行檢驗。

1.2.5 脂肽類抗菌活性物質合成相關基因的分析 參考Mora等［7］的方法，PCR擴增菌株R1B 基因組 DNA，篩選其是否含有合成相關抗菌物質的基因，包括srfAA（surfactin表面活性素），ituC（iturin伊枯草菌素），bmyB（bacyllomicin桿菌抗霉素），fenD（fengycin豐原素），spaS（subtilin枯草菌素），以及bacA（bacilysin溶桿菌素）。表1是使用的引物信息［7］。50 μL 的 PCR 反應體系包括：Premix Taq 25 μL，濃度為 10 μM 的引物各 2 μL，DNA 2 μL（20 ng），ddH2O 補足至 50 μL。PCR 反應條件為 ：95℃預變性3 min，94℃變性1 min，退火1 min，70℃延伸1 min，共進行40 個循環，循環結束后70℃延伸5 min，其中srfAA，ituC，fenD，bacA和spaS退火溫度為58℃，bmyB退火溫度為55℃。擴增產物由北京諾賽有限公司純化后進行測序。測序獲得的基因序列利用BLAST在GenBank 數據庫中進行同源性檢索及比對分析，并提交到 Genbank：bacA（MK174675）、ituC（MK174678）、bmyB（MK174676） 及fenD（MK174677）。

2 結果

2.1 梨軟腐病拮抗菌的篩選

從霍山石斛、花生及蘭州百合的葉片和根組織中分離獲得的內生菌共 65 株，利用對峙培養法篩選拮抗軟腐病菌的內生菌。軟腐病菌生長迅速，1 d即可滿皿（圖 1-B），大多數內生菌被軟腐病菌覆蓋吞噬，無拮抗活性；而菌株R1B表現出一定的抑菌作用，R1B 周圍有明顯的抑菌帶（0.5-1 cm），10 d后依然清晰（圖 1-A）。

表1 用于菌株R1B脂肽類抗菌活性物質相關合成基因分析的引物［7］

圖1 菌株R1B對軟腐病菌的抑菌作用

2.2 菌株R1B對軟腐病菌菌絲生長的影響

結果如圖 2 所示，在菌株R1B作用下，軟腐病菌幾乎不能生長，菌絲斷裂、自溶（圖2-A），而對照病菌菌絲生長旺盛（圖2-B）。說明菌株R1B可完全抑制軟腐病菌菌絲的生長。

2.3 菌株R1B在防治梨果實軟腐病中的應用

菌株R1B對梨果實軟腐病的防治作用如圖3、表 2 所示，接種軟腐病菌匍枝根霉后，對照組發病迅速，在接種軟腐病菌2 d后，對照組病斑直徑已達6-9 cm，R1B處理組可以完全抑制梨果實軟腐病的發生；4 d后，對照組梨果實全部腐爛，滲出大量的液體，且布滿黑色菌絲和孢子；而R1B處理組依然100% 抑制梨果實軟腐病的發生；12 d后R1B處理組開始發病。實驗結果表明R1B對梨果實軟腐病的發生有很好的防治作用。

圖2 菌株R1B處理后軟腐病菌菌絲形態的變化（放大倍數：400×）

圖3 菌株R1B對梨軟腐病的防治作用

表2 R1B對梨果實軟腐病的防治作用

2.4 菌株R1B的鑒定

2.4.1 菌株R1B的生理生化的鑒定 菌株R1B在LB 培養基上生長良好，生長 2 d的菌落扁平圓形，乳白色不透明，邊緣鋸齒狀，表面粗糙顆粒狀。菌株R1B的生理生化特性如表 3 所示，菌株R1B屬于好氧菌，甲基紅實驗陰性，接觸酶反應、明膠水解、淀粉水解、VP 實驗均為陽性；可以很好地利用葡萄糖、蔗糖和甘露醇以及D-木糖和D-阿拉伯糖；可以在10% NaCl 中生長，具有較高的耐鹽性；在50℃可以生長，但在 28-37℃ 條件下生長最好。根據《常見細菌系統鑒定手冊》，將菌株R1B初步鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillus）細菌。

表3 菌株R1B的生理生化特性

2.4.2 菌株R1B16S rDNA 的分子鑒定 將獲得的菌株R1B 16S rDNA序列利用BLAST在GenBank中進行同源比對分析，選擇同源性較高的序列作為參考序列，構建系統發育樹。結果（圖4）顯示，菌株R1B屬于芽孢桿菌屬Bacillus，與Bacillus velezensis典型菌株MG846018聚為一簇，具有最近的親緣關系。

2.5 脂肽抗生素合成相關基因序列分析

圖4 菌株R1B的16S rDNA系統發育樹

利用6對引物，分別PCR擴增菌株R1B基因組DNA，獲得4條目標片段。將其測序后進行BLAST 同源性分析，結果表明從菌株R1B 擴增的bacA基 因（MK174675） 與B. amyloliquefaciensRNB-92（AB973461）中溶桿菌素合成酶bacA基因的同源性為99%，bmyB基因（MK174676）與B.amyloliquefaciens（KY111359）桿菌抗霉素 D合成酶基因bmyB同源性為99%，擴增獲得的ituC基因（MK174678）與B. siamensisH1401（MG009462）和B. subtilis（AB050629）中的伊枯草菌素 A合成酶基因ituC同源性為98% 和99%，擴增的fenD基因（MK174677）與B. amyloliquefaciens32a（KP453873）中的豐原素合成酶基因fenD同源性為97%。

根據測序結果，菌株R1B基因組中可能存在溶桿菌素、桿菌抗霉素、伊枯草菌素、豐原素合成的操縱子序列，菌株Y1B可能產生抗菌二肽溶桿菌素和2類脂肽類抗菌物質。

3 討論

果蔬軟腐病可在世界范圍內發生，軟腐病菌匍枝根霉寄主廣泛，可危害多種果蔬，其生長迅速，短時間內可引起果蔬的大量腐爛造成重大的經濟損失。目前生產上主要采用化學農藥來防治軟腐病。由于全球對化學殺蟲劑的濫用以及由此引起的對健康和環境嚴重的副作用的擔心，迫切需要采取環境友好的生物防治方式［8-9］。能產生多種廣譜性的抗菌活性物質［10］，并且抗逆性強，在惡劣的條件下可以形成孢子度過不利的環境條件保存活力，相比其他生防菌具有明顯優勢的芽孢桿菌［11］是有希望能應用于生物防治的微生物。

本研究通過對實驗室分離保存的多種植物內生菌進行篩選，獲得了一株來自石斛的具有較好抑菌效果的菌株 R1B，通過生理生化和分子鑒定，表明菌株R1B與貝萊斯芽孢桿菌Bacillus velezensis具有最近的親緣關系。前期研究表明，貝萊斯芽孢桿菌對多種植物病原菌具有抑菌活性，孫平平等［12］報道貝萊斯芽孢桿菌 L-1 能夠顯著抑制梨灰霉與青霉菌的擴展；張新剛等［13］報道貝萊斯芽孢桿菌SFJ1可以防治黃瓜灰霉病；杜淑濤等［14］發現貝萊斯芽孢桿菌DL-59對白菜黑斑病具有良好的防治效果。我們的實驗結果與前期的研究結論一致，在菌株R1B作用下，菌絲斷裂自溶，幾乎完全不能生長；R1B對梨果實軟腐病的發生也具有良好的防治作用，在接種軟腐病菌 4 d后，對照組梨果實全部腐爛，而R1B處理組完全抑制梨果實軟腐病的發生，說明菌株R1B在梨采后病害的生物防治方面有一定的開發利用潛力。

芽孢桿菌的拮抗活性主要是通過產生抗菌活性物質來發揮作用，包括非核糖體途徑合成的抗菌多肽類、脂肽類和聚酮類化合物以及核糖體途徑合成的抗菌蛋白如細菌素等［15］，這些活性物質的產生與其生防效果具有密切的關系。脂肽類化合物是芽孢桿菌產生的主要的抑菌活性物質，主要包括表面活性素（Surfactin）、伊枯草菌素（Iturin）、豐原素（Fengycin）三大家族，其中伊枯草菌素、豐原素對真菌有強烈的拮抗作用［15］，而表面活性素可以幫助芽孢桿菌在宿主上定殖［16］。通過PCR擴增菌株R1B基因組DNA，我們發現菌株R1B基因組中可能存在桿菌抗霉素（Bacyllomicin）、伊枯草菌素（Iturin）、豐原素（Fengycin）合成的操縱子序列，菌株R1B可能產生2大類脂肽類抗菌物質伊枯草菌素（Iturin）和豐原素（Fengycin）。

非核糖體合成的活性抗菌物質除了脂肽類外還包括許多其他次生代謝產物，如抗菌二肽溶桿菌素（Bacilysin）結構簡單，僅由2個氨基酸組成，其可以抑制真菌和細菌細胞壁的合成，導致微生物細胞結構損傷，從而使細胞溶解死亡，對細菌和真菌都具有廣譜抗菌活性［17］，因此在農業和醫藥領域具有廣闊的應用潛力。我們通過PCR探測到菌株R1B基因組中含有溶桿菌素合成的基因序列，R1B可能產生溶桿菌素發揮抗菌活性。

核糖體途徑合成的細菌素是一類具有抗菌生物活性的蛋白質或多肽類物質［18］，枯草菌素（Subtilin）是迄今為止研究得比較清楚的細菌素之一。因其具有高效抗菌活性和無殘留毒副作用而被廣泛地應用，并且細菌素無耐藥性，極有可能替代傳統抗生素應用于生物醫藥和生物防治領域［19-20］。但是我們在用PCR探測時，沒有發現R1B基因組中含有合成枯草菌素的基因簇，說明R1B的抗菌活性可能是通過產生抗菌二肽溶桿菌素以及伊枯草菌素和豐原素發揮作用。

4 結論

通過篩選不同植物來源的內生菌發現，來源于霍山石斛的菌株R1B具有顯著的抗菌活性，可以強烈抑制梨軟腐病菌匍枝根霉的生長，對梨軟腐病具有良好的防治效果，具有開發成生物農藥的潛力。經鑒定R1B與貝萊斯芽孢桿菌具有最近的親緣關系。通過PCR探測R1B基因組，結果表明R1B可能產生抗菌二肽溶桿菌素以及伊枯草菌素和豐原素，而該菌株的抑菌活性是僅取決于其中一種活性物質，還是不同活性物質協同作用的結果，還有待進一步的實驗來闡明。