杜氏鹽藻DsKASIII基因的分離鑒定及其在氮脅迫下的表達分析

高慧玲 劉寶玲 高宇 張飛 薛金愛 李潤植

（山西農業大學分子農業與生物能源研究所，太谷 030801）

杜氏鹽藻（Dunaliellasalina），是一種嗜鹽的單細胞真核藻類，屬于綠藻門、團藻目、鹽藻科、鹽藻屬，為綠色單細胞的浮游植物。鹽藻細胞沒有纖維質的細胞壁，細胞體形微小，長約為14-22 μm，寬3-14 μm，有橢圓、卵圓和長頸瓶等不同形態［1］。杜氏鹽藻能在高鹽（22%-30% NaCl）條件下生長，生活條件不良時鹽藻細胞會大量合成β-胡蘿卜素和血紅素，藻體呈紅色，會把湖水染成紅色或粉紅色［2］。鹽藻很容易規模化培養，能夠作為生物反應器表達一些重要的基因而合成積累目標化合物［3-4］。杜氏鹽藻含有豐富的油脂、蛋白質和β-胡蘿卜素等［5］，在食品、醫藥保健以及化工等產業中具有獨特經濟價值。尤其是鹽藻細胞油脂含量可達細胞干重的39%-44%［6］，集約化養殖可聯產優質食用油脂或生物柴油［7-8］，具有不與人爭地、爭糧的優勢［9-10］。鑒于杜氏鹽藻含油量高、且含有較多的油酸和亞麻酸等多不飽和脂肪酸，鹽藻被認為是生產優質食用油或工業用油脂的天然生物原料之一［11］。因此，研究鹽藻細胞油脂合成積累及調控機制有助于富油鹽藻株系的培育及其產業化應用。

β-酮脂酰 -ACP合酶III（β-ketoacyl-ACP synthase III，KASIII）催化乙酰 -CoA（acetyl-CoA）（2C）與丙二酰-ACP（malonyl-ACP）（3C）縮合生成乙酰乙酰-ACP（acetoacetyl-ACP）（4C）進入碳鏈延伸循環。乙酰乙酰-ACP經第一次還原、脫水、第二次還原反應生成丁酰-ACP（butyryl-ACP）（4C）。丁酰-ACP再次經縮合-還原-脫水-再還原循環延長碳鏈，每次循環添加2個C原子，直至14或16C。KASIII作為啟動質體中脂肪酸從頭合成的關鍵酶之一，在植物油脂合成代謝途徑中發揮著重要的作用。已有研究表明，在植物體內，KASIII的活性影響脂肪酸合成速率，并且受到脂酰鏈延伸終產物（酯酰-ACP）的反饋抑制［12］。KASIII活性強弱決定著脂肪酸碳鏈的延伸長度。例如，在萼距花（Cuphea hookeriana）種子中，KASIII活性受到癸酰-ACP的抑制可產生不同長度的脂肪酸［13］。在煙草（Nicotiana tabacum）中，過表達菠菜（Spinacia oleracea）KASIII基因，棕櫚酸（C16：0）含量明顯增加［14］。將乳酸乳球菌KSAIII活性位點突變后，乳酸乳球菌不能在缺乏長鏈脂肪酸的培養基中正常生長，這表明KASIII也是細菌脂肪酸合成必需的關鍵酶［15］。

近年來，人們相繼研究了油桐（Vernicia fordii）［16］、麻風樹（Jatropha carcas）［17］和向日葵（Helianthus annuus）［18］等植物的KASIII基因及其功能。Du等［19］于2018年發現亞洲棉（Gossypium arboreum）GaKASIII酶保守域中氨基酸的改變能決定合成脂肪酸的種類。例如，在ACP_synthase_III_C結構域的半胱氨酸（TGT）被精氨酸（CGT）取代，結果導致原先不生成棕櫚油酸（C16：1）的種子大量合成并積累了C16：1［19］。杜氏鹽藻作為一種重要的單細胞經濟藻種，含有豐富的脂肪酸（如棕櫚酸、油酸、亞油酸和亞麻酸等），然而還未見其KASIII基因和蛋白特征及功能的報道。為此，本文分離鑒定杜氏鹽藻的DsKASIII基因，并系統分析其編碼酶蛋白的理化特性和亞細胞定位及功能預測。重點檢測氮脅迫條件下KASIII基因的表達譜及對藻細胞油脂和β-胡蘿卜素合成積累的影響，以期為進一步全面解析鹽藻油脂和β-胡蘿卜素合成機制和建立鹽藻規模化養殖富集油脂的調控技術提供新的科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗所用的杜氏鹽藻（Dunaliellasalina）藻株SXAU-DS-01來自山西農業大學能源微藻種質庫。

1.2 方法

1.2.1 取樣 正常培養采用DM培養基，培養溫度為25℃，光照強度為6 000 lx，光暗比為12 h：12 h。將正常培養生長的杜氏鹽藻培養到8 d后，離心（8 000 r/min，3 min）收集藻體沉淀，經無菌水清洗后，一部分懸浮在缺1/2氮的DM培養基中，一部分懸浮于正常的（氮充足）DM培養基中，分別在培養1 d、3 d、6 d和9 d時，離心收集藻樣，經液氮速凍后存于-80冰箱備用。

1.2.2 引物設計與合成 從Phytozome v12.1數據庫（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）中查找杜氏鹽藻的全基因組數據，并鑒定確認DsKASIII基因的完整序列（Dusal.0826s00002.1）［20］。用 Vector NTI軟件對DsKASIII基因編碼序列設計用于PCR擴增的特異性引物（表1中DsKASIII引物），并由TSINGKE 生物技術公司合成。

表1 實驗所用的qRT-PCR引物

1.2.3 杜氏鹽藻總RNA的提取及反轉錄 采用ABM公司的RNA試劑盒提取藻樣的總RNA，經1%瓊脂糖凝膠電泳及其純度檢測后，將其反轉錄成為cDNA 20 μL。 反轉錄體系為 ：AccuRT Reaction Stopper（5X）2 μL，5X All-In-One RT MasterMix 4 μL，RNA模板 1 μg，用 Nuclease-free H2O 補足到 20 μL。

1.2.4DsKASIII基因的克隆 以反轉錄得到的杜氏鹽藻cDNA為模板進行PCR擴增，20 μL擴增體系包括：2 μL cDNA，0.4 μL正向引物與反向引物（表1 中 DsKASIII引 物，10 nmol/L），10 μL 2×Easypfu PCR SuperMix，7.2 μL Nuclease-free H2O。反應條件為：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸 1 min，35 個循環，72℃ 延伸 10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳分離，割膠回收目標PCR產物。將PCR產物克隆到pEASY?-Blunt Zero-T載體并轉化大腸桿菌DH5α，送至公司進行測序。

1.2.5 杜氏鹽藻DsKASIII的序列分析

1.2.5.1 杜氏鹽藻DsKASIII編碼蛋白理化特性分析 利 用 在 線 GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn）對DsKASIII進行基因結構（Intron-exon）分析，依據保守結構域數據庫（Conserved Domain Database，CDD）（https：//www.ncbi. nlm.nih.gov/Structure/cdd/）鑒定DsKASIII蛋白的保守域。通過ExPasy網站的ProtParam 工 具（http：//web.expasy.org/protparam/）分析DsKASIII蛋白的理化性質。應用Target P 1.1 Server（http ：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP-1.1/）預測DsKASIII蛋白的亞細胞定位。依據TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/） 和ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/） 工 具分析DsKASIII蛋白的跨膜結構和疏水區。運用SOPMA（http：//metadatabase.org/wiki/SOPMA） 和SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）分別預測DsKASIII的二級結構和三級結構。

1.2.5.2 杜氏鹽藻DsKASIII蛋白的系統發育分析 使用MEGA 6.06軟件對DsKASIII的氨基酸序列與其他14種不同植物的KASIII蛋白的氨基酸序列進行ClustalW 多序列比對。這14種植物包括江南卷柏（XP_002984971.1）、小立碗蘚（XP_001754014.1）、深圳擬蘭（PKA66631.1）、油麥菜（PLY93166.1）、海棗（XP_008802619.1）、大豆（NP_001237735.1）、短 花 藥 野 生 稻（XP_006652901.2）、 小 球 藻（XP_005847747.1）、衣藻（GAX79646.1）、膠球藻（XP_005642863.1）、 念 珠 藻（WP_012406929.1）、鈍 頂 節 旋 藻（WP_006617507.1）、 萊 茵 衣 藻（PNW83774.1）、 團 藻（XP_002951005.1）、 大 腸桿菌（NP_415609.1）。然后采用鄰接法（Neighbor-Joining，N-J）構建無根系統發育樹，自舉檢驗值設置1 000個循環，采用p-distance模式。

1.2.6 杜氏鹽藻DsKASIII基因在氮脅迫條件下的表達分析 取氮脅迫培養和正常培養不同時間的藻細胞樣品，分別制備cDNA。以各樣品cDNA為模板，采用熒光定量PCR分析DsKASIII基因的表達。PCR反 應 體 系 為 ：EvaGreen 2X qPCR MasterMix 10 μL，正向和反向引物各 0.6 μL，cDNA 1 μL，補加 7.8 μL的Nuclease-free H2O至總體積20 μL，設置3個重復。實驗結果采用2-ΔΔCq法計算出相對表達量數值，并通過Excel和SPASS分析數據后繪制柱狀圖。

1.2.7 杜氏鹽藻總脂肪酸提取及測定 利用氯仿-甲醇法提取正常培養與缺氮培養條件下的杜氏鹽藻的總脂。將杜氏鹽藻培養到對數期（6 d），冷凍干燥得到藻粉。稱取100 mg的藻粉，加入3 mL甲醇：氯仿（2∶1）溶液，混勻4 000 r/min離心10 min。取上層有機相并加入0.8 mL的0.75%的NaCl溶液，振蕩15 min。下層樣品殘渣中加入1 mL的氯仿溶液，混勻后4 000 r/min離心10 min。取上層有機相加入1 mL 0.75%的NaCl溶液，振蕩15 min。收集振蕩后的兩管溶液于一個試管，混勻，離心（4 000 r/min，10 min）后，吸取下清有機相至已稱重的新管中，55℃水浴蒸干后稱管重。每個樣品重復3次。計算方法：總脂含量=（加入樣品蒸干后的管重-加入樣品前的管重）/藻粉重

1.2.8 杜氏鹽藻β-胡蘿卜素的提取及測定 取10 mL藻液，4 000 r/min離心5 min。棄上清，在藻細胞沉淀中加入10 mL 80%丙酮溶液提取色素，萃取2-3次，至藻體呈灰白色。最后將萃取液定容到50 mL。用分光光度儀檢測萃取液在450 nm處的吸光值，根據Jensen［21］公式換算出β-胡蘿卜素含量。

β-胡 蘿 卜 素（mg/L）=（OD450× 稀 釋 倍數 ×10×103）/2 500

2 結果

2.1 杜氏鹽藻DsKASIII基因的cDNA克隆與編碼蛋白理化特征分析

以杜氏鹽藻SX-DS-01藻株的cDNA為模板，PCR擴增獲得DsKASIII基因完整的開放閱讀框（ORF），大小為960 bp（圖1），編碼319個氨基酸。DsKASIII基因DNA序列長約16 kb，含有9個較短的外顯子和8個較長的內含子（圖2-B）。保守結構域分析顯示，DsKASIII蛋白在107 aa和244 aa處分別含有活性位點和輔酶A結合結構域，且含有眾多二聚體結合點。該蛋白具有KASIII家族的典型特征（圖2-A），以二聚體形式發揮催化功能。DsKASIII蛋白相對分子量為33.29 kD，理論等電點（pI）為6.21。亞細胞定位預測該蛋白具有葉綠體轉運肽，定位于質體。

圖1 杜氏鹽藻KASIII基因PCR擴增產物的電泳圖

圖2 DsKASIII蛋白的保守結構域（A）和基因結構（B）

2.2 杜氏鹽藻DsKASIII蛋白的結構分析

應用TMHMM分析蛋白跨膜結構域顯示，DsKASIII蛋白中間部位（99-122 aa）和C末端（297-318 aa）在質體內膜上呈鑲嵌狀態。這種跨膜分布模式可能有助于該蛋白在催化脂肪酸合成過程從內膜上獲取能量（圖3-A）。ProtScale分析DsKASIII蛋白疏水性/親水性的結果（圖3-B）表明，該蛋白的C末端（279-291 aa和296-315 aa）和中間部分（101-119 aa，127-137 aa）均存在明顯的疏水區，且位置大致和上述跨膜區相一致。這表明DsKASIII蛋白的中間區段可能主要結合并催化底物脂肪酰-ACP，而C末端可能負責將整個蛋白錨定在質體內膜上，對蛋白起一定的固定作用。

圖3 杜氏鹽藻DsKASIII蛋白的跨膜結構域（A）和疏水結構域（B）

預測的DsKASIII蛋白二級結構主要包括ɑ-螺旋，β片層和無規則卷曲，分別為35.11%，25.71%和27.90%，而β-轉角較少，僅為11.29%（圖4-A）。通過用PDB數據庫中的大腸桿菌（E. coli）KASIII蛋白結構為模板（圖4-C），對DsKASIII蛋白進行同源建模發現，DsKASIII以同源二聚體形式存在，且均勻對稱（圖4-B）。與E.coliKASIII不同，DsKASIII蛋白的外側不存在輔酶A配體。E.coliKASIII和DsKASIII蛋白序列相似度為41.54%。

2.3 杜氏鹽藻DsKASIII蛋白多序列比對及系統發育分析

圖4 杜氏鹽藻DsKASIII的二級結構（A）和三級結構（B）（注：C為大腸桿菌E.coli KASIII）

利用MEGA 6.06軟件對杜氏鹽藻以及14個來源于其他植物的KASIII蛋白序列進行ClustalW 多序列比對（圖5）。DsKASIII與原核大腸桿菌KASIII僅具有38%的序列相似性，而與真核衣藻KASIII的序列相似性高達57%。DsKASIII蛋白在第107位置為半胱氨酸（Cys），是KAS酶在脂肪酸循環過程中的酰化位點。DsKASIII還含有兩個起催化作用的關鍵活性位點殘基His244和Asn275。圖5還顯示，KASIII蛋白在真核高等植物、微藻及細菌中的關鍵氨基酸（圖5紅色框標注）是完全相同的，這表明盡管不同物種的KASIII蛋白序列差異較大，但在重要功能區，關鍵氨基酸則是高度保守的。這些位點在脂肪酸從頭合成中發揮著至關重要的作用。

采用鄰接法（N-J法）對各物種KASIII蛋白構建系統發育樹。結果（圖6）表明，杜氏鹽藻DsKASIII蛋白與其他微藻的KASIII蛋白聚為一組，明顯區別于高等植物組和原核組。盡管各物種KASIII可行使相同的功能，但在漫長進化過程中，原核類、真核微藻和真核高等植物KASIII蛋白亦產生了一定的結構和催化特性差異。在所檢測的微藻中，DsKASIII和衣藻CeKASIII的同源關系最近，可能二者在進化過程中有著較近的祖先來源。

2.4 DsKASIII基因在氮脅迫條件下的表達分析

檢測杜氏鹽藻DsKASIII基因在正常培養（氮充足）與氮脅迫情況下的表達譜（圖7）顯示，在正常培養和氮脅迫培養條件下，DsKASIII基因的表達均表現出先升高后降低的趨勢，但在氮脅迫培養條件下DsKASIII表達量顯著高于正常培養條件下的表達量。氮脅迫第3天時，DsKASIII表達量達峰值，比正常培養3 d的表達量提高了1.1倍。氮脅迫第3天DsKASIII表達量比第1天增加了72.94%。然而，DsKASIII在正常培養3 d的表達水平僅比1 d時提高了37.48%。氮脅迫培養第9天DsKASIII的表達量仍比正常培養第9天的表達量高1.39倍。總之，與正常培養相比，在氮脅迫培養前期，DsKASIII快速上調表達，培養后期表達量下降緩慢。

圖5 DsKASIII與其他物種KASIII的蛋白序列比對

2.5 氮脅迫對杜氏鹽藻總油脂和β-胡蘿卜素積累的影響

取對數期生長的正常培養與氮脅迫培養的杜氏鹽藻樣品測試藻細胞總油脂含量（圖8-A）顯示，與正常培養條件相比，氮脅迫培養的藻細胞總脂含量提高了49.05%。由圖8-B可知，氮脅迫能促進杜氏鹽藻β-胡蘿卜素的合成，β-胡蘿卜素含量比正常培養藻細胞增加了33.20%。

3 討論

圖6 DsKASIII和其他物種KASIII蛋白的系統發育樹

圖7 氮充足和氮脅迫培養條件下杜氏鹽藻DsKASIII基因的表達分析（A：半定量PCR；B：qRT-PCR）

杜氏鹽藻及富油微藻是一類優異生物油脂資源［22］，因其高效固碳、生長周期短、適應性強、容易大規模養殖等優點，正日益發展成為制備優質食用油脂及生物柴油等產業的原材料［23］。解析微藻油脂生物合成機制和建立提高微藻油脂積累的調控技術是微藻油脂商業化開發利用的關鍵任務之一。KASIII在脂肪酸合成第一步的縮合反應中催化乙酰-CoA和丙二酰-ACP生成乙酰乙酰-ACP。不少研究認為KASIII在脂肪酸生物合成起始反應中行使重要功能，是細胞油脂合成積累的限速酶之一［24］。研究表明，細菌、真菌、真核藻類和多種植物的KASIII蛋白在結構、作用底物及功能方面具有多樣性。

圖8 氮充足和氮脅迫培養條件下杜氏鹽藻總脂和β-胡蘿卜素的含量

本文分離鑒定了杜氏鹽藻的DsKASIII基因并獲得了杜氏鹽藻中編碼KASIII基因的cDNA序列全長。杜氏鹽藻KASIII基因含有9個外顯子，開放閱讀框全長為960 bp，編碼319個氨基酸，預測的等電點為6.21，分子量為33.3kD。DsKASIII蛋白具有葉綠體轉運肽，定位于質體且鑲嵌式錨定在葉綠體內膜上。DsKASIII以同源二聚體形式行使催化脂肪酸合成起始縮合反應的功能。DsKASIII蛋白與原核大腸桿菌EcKASIII蛋白不同，DsKASIII沒有輔酶A配體。E.coliKASIII和DsKASIII蛋白序列相似度為41.54%，遠高于不同細菌KASIII之間的相似度，如單黃胞菌（Xanthomonas oryzae）KASIII與大腸桿菌KASIII序列相似度僅為23.3%［25］。顯然，不同物種之間KASIII蛋白序列差異性較大，其催化合成脂肪酸的方式和對底物的特異性結合也可能具有明顯的差異［26］。DsKASIII蛋白含有3個起催化作用的關鍵活性位點殘基Cys107，His244和Asn275。與DsKASIII這3個關鍵位點相一致的是，已有報道惡性瘧原蟲KASIII蛋白（PfKASIII）的催化中心也具有此類位點，分別為Cys159，His298和Asn328［27］，進一步暗示這個基因編碼DsKASIII蛋白。

杜氏鹽藻DsKASIII基因在氮脅迫條件下第三天的表達量達到最高峰，比正常培養高1.1倍，表明氮脅迫明顯誘導DsKASIII基因的上調表達。與之相似的是，氮脅迫可顯著誘導杜氏鹽藻DsFAD2基因的上調表達［28］。這些油脂合成相關基因的上調表達勢必影響到藻細胞油脂的合成積累。總脂含量測定顯示，氮脅迫條件下杜氏鹽藻的總脂比對照提高了49.05%，且β-胡蘿卜素含量也比對照增加了33.20%，可能DsKASIII基因的上調表達也促進了藻細胞油脂和β-胡蘿卜素含量的升高。姚杰利用半連續缺氮方式培養的杜氏鹽藻油脂含量比對照組提高了70.4%［29］。已有研究發現氮脅迫亦可誘導其他微藻大量合成積累油脂。例如，低氮（0.75g/L）培養的氮濃度下小球藻產油量明顯升高，為標準氮濃度（1.5g/L）培養的藻細胞油脂含量的1.4倍［30］。Hu等［31］證明氮脅迫使杜氏鹽藻細胞調整了N元素的代謝方向，葉綠素、蛋白等含氮化合物合成減少而糖含量增加，為脂類的合成積累提供了豐富的碳骨架，從而使油脂含量提高。這些研究結果表明，氮脅迫可顯著上調藻細胞油脂的合成積累。孫輝等人發現氮元素的缺乏對杜氏鹽藻合成β-胡蘿卜素有促進作用［32］，葉綠素是含氮的光合色素，而β-胡蘿卜素是不含氮的色素。氮脅迫必然限制葉綠素的合成甚至降解。β-胡蘿卜素的及時合成積累，可防護質體光合作用的進行［33］。亦有研究指出，油脂代謝產物為β-胡蘿卜素的合成提供了起始原材料［32］，這也許是在氮脅迫下，隨著油脂合成升高，β-胡蘿卜素積累增多的部分原因。進一步需要開展氮脅迫條件下杜氏鹽藻多組學聯合分析以期從分子水平上認識脅迫相應及代謝重構的分子機制。

4 結論

本文分離獲得了杜氏鹽藻的DsKASIII基因，并系統解析了該酶蛋白的理化特性和在氮脅迫條件下DsKASIII基因表達譜及其對油脂和胡蘿卜素積累的影響。杜氏鹽藻KASIII基因含有9個外顯子，ORF為960 bp，編碼319個氨基酸。DsKASIII具有KASIII酶蛋白家族典型結構域，定位于葉綠體，以二聚體行使功能。缺氮脅迫誘導DsKASIII基因上調表達并促進鹽藻細胞油脂和β-胡蘿卜素的合成積累。本研究為全面解析微藻油脂和β-胡蘿卜素合成調控機制以及后續應用基因工程策略提高杜氏鹽藻目標化合物的富集等方面提供重要的科學依據。