IL1RAP在健康奶牛與患子宮內膜炎奶牛子宮內膜組織間表達差異的研究

陳秀竹，常 迪*，黃啟震，王 瑞，王天坤，盛熙暉，齊曉龍，王相國，郭 勇，刑 凱，倪和民，谷傳慧

(1.北京農學院 動物科學技術學院，北京 102206；2.昌平區動物疫病預防控制中心，北京 102200； 3.北京市動物疫病預防控制中心，北京100029)

子宮內膜炎是奶牛常見的產科疾病，主要病因是子宮內侵入病原微生物導致子宮內膜發生炎癥。子宮內膜炎主要損傷子宮內膜的上皮細胞，使子宮內積膿，并影響早期胚胎著床等生殖過程，導致奶牛的繁殖性能下降[1]。臨床研究顯示，奶牛子宮內膜炎主要分為臨床型子宮內膜炎和亞臨床型子宮內膜炎兩種類型。由于各種炎癥在子宮內侵襲的程度上存在差異，所以修復子宮內膜所需要的時間存在差異，進而對母牛繁殖性狀的影響也存在差異。國內外都有大量該病的研究報道，不同地區子宮內膜炎的發病情況各有不同[2]。另外，由于患病牛自身的免疫能力存在差異，也導致奶牛的發病情況有所不同[3]。當前，該病的診斷方法有直腸檢查這類常規方法，還包括細胞學檢查以及PCR技術在內的新技術[4]，應用分子標記技術對母牛遺傳免疫進行了相關的分析和研究，對致病菌進行快速的歸類，以尋找到更好的預防和治療子宮內膜炎最有效的辦法。目前一項研究顯示，在牛對由子宮內膜炎等細菌感染導致的疾病的抵抗能力方面，細胞白介素1受體輔助蛋白(interleukin 1 receptor accessory protein，IL1RAP)基因可對該種免疫力加以提高，并且IL1RAP是牛子宮內膜炎的抗性候選基因[4]。

IL1RAP最先被鑒定為小鼠細胞中的IL-1型受體復合物的亞基，其有助于受體對IL-1的親和力，并且是IL-1信號轉導所必需的基因[5-10]。IL1RAP是IL-1信號傳導中所需的受體配偶體，表達翻譯形成膜IL1RAP和可溶性IL1RAP 兩種形式，并且在機體中廣泛表達[11-12]。有研究表明，IL1RAP可以當做新型的白血病干細胞表面標志蛋白[13]。也有研究表明，IL1RAP在人類子宮內膜異位癥患者中的外周血以及子宮組織中表達下降，而子宮內膜異位癥導致子宮發炎[14]。探明IL1RAP在健康奶牛與患子宮內膜炎奶牛間的表達差異，初步驗證IL1RAP與奶牛子宮內膜炎的關系，為將IL1RAP作為奶牛子宮內膜炎的抗性基因提供試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用荷斯坦奶牛，挑選年齡相仿且經產2次的健康奶牛3頭及經產2次的患子宮內膜炎奶牛3頭。

1.2 樣品采集與檢測

觀察奶牛外陰部位是否存在污濁分泌物進行初步選定，操作人員通過奶牛的陰道分泌物涂片，鑒別奶牛是否患有子宮內膜炎，通過鑒別子宮內病灶聲像顯示圖并且通過儀器測量子宮頸的直徑厚度以及依據子宮內液體的反射強度來確診患病奶牛。

將經產健康奶牛3頭，經產患子宮內膜炎奶牛3頭，屠宰后分別取其子宮組織，然后將子宮組織迅速剪成1 cm見方的小組織塊，隨后快速置入液氮中處理，待冷凍完全后，將其置于處理過的離心管中并作標記，在-80 ℃冰箱中保存備用。

將子宮組織塊進行熒光PCR技術檢測,以GAPDH為參照，將cDNA樣品稀釋10倍，作為模板上機檢測，所用等引物序列如表1。

western blot檢測，組織塊提取蛋白后，利用兔抗IL1RAP多克隆抗體以及Anti-rabbit IgG二抗進行試驗。

表1 基因的引物序列Tab.1 Primer sequences of genes

利用Excel軟件匯總數據，熒光PCR數據分析方法為2-ΔΔCt相對定量分析方法，采用SPSS軟件對檢測數據進行t檢驗分析。

2 結果與分析

2.1 奶牛的IL1RAP mRNA相對表達量

熒光定量PCR內參基因GAPDH以及目的基因IL1RAP的擴增曲線如圖1，熒光定量PCR內參基因GAPDH及目的基因IL1RAP的溶解曲線如圖2。通過擴增曲線可以看出反應效果良好，并且通過溶解曲線分析IL1RAP以及GAPDH基因分別在81.97 ℃及86.67 ℃處，出現單一產物峰。

以內參基因GAPDH為內標，SYBRGreen染色法對IL1RAP mRNA在奶牛子宮組織中的相對表達量進行PCR檢測，其中健康奶牛子宮組織中IL1RAP mRNA的相對表達量顯著高于患子宮內膜炎奶牛子宮組織中IL1RAP的相對表達量(P<0.05),如圖3所示。

圖1 內參基因GAPDH的擴增曲線(左)目的基因IL1RAP的擴增曲(右)Fig.1 Amplification curve of the internal reference gene GAPDH (left) Amplification of the target gene IL1RAP (right)

圖2 內參基因GAPHD的溶解曲線(左)目的基因IL1RAP的溶解曲線(右)Fig.2 Dissolution curve of the internal reference gene GAPDH gene (left) Dissolution curve of target gene IL1RAP (right)

圖3 健康奶牛與患病奶牛子宮組織中IL1RAP的mRNA相對表達量Fig.3 mRNA Relative expression of IL1RAP in uterus tissue of healthy and diseased cows

2.2 奶牛的IL1RAP 蛋白相對表達量

通過Western Blot電泳試驗，以β-catin為內參基因，得出電泳圖如圖4所示。圖5為IL1RAP 蛋白在奶牛子宮組織中的相對表達量，可以看出健康奶牛子宮組織中IL1RAP蛋白的相對表達量極顯著高于患子宮內膜炎奶牛子宮組織中IL1RAP蛋白的相對表達量(P<0.01)，IL1RAP蛋白相對表達量與奶牛子宮內膜炎存在相關性。

健康奶牛1號(Z1)子宮組織與患子宮內膜炎奶牛1號(H1)子宮組織中IL1RAP蛋白的表達量圖。健康奶牛2號(Z2)子宮組織與患子宮內膜炎奶牛2號(H2)子宮組織中IL1RAP蛋白的表達量圖。健康奶牛3號(Z3)子宮組織與患子宮內膜炎奶牛3號(H3)子宮組織中IL1RAP蛋白的表達量圖圖4 奶牛子宮組織中IL1RAP蛋白表達檢查結果 The expression level of IL1RAP protein in uterus tissue of healthy cow No. 1 (Z1) and uterus of endometritis cow No. 1 (H1). The expression level of IL1RAP protein in uterus tissue of healthy cow No. 2 (Z2) and uterus tissue of endometritis cow No. 2 (H2). Expression of IL1RAP protein in uterus tissue of healthy cow No. 3 (Z3) and endometritis cows No. 3 (H3)Fig.4 Results of IL1RAP protein expression in cow uterus tissue

圖5 IL1RAP 蛋白在奶牛子宮組織中的相對表達量Fig.5 Relative expression of IL1RAP protein in dairy uterus

2.3 討 論

IL1RAP首先被鑒定為小鼠細胞中的IL-1受體復合物的亞基，其有助于受體對IL-1的親和力[5,6]，是IL-1信號轉導所必需的物質[7-10]。試驗表明，人類編碼IL1RAP的基因位于染色體3q28上[12]，通過表達翻譯，形成膜 IL1RAP 和可溶性 IL1RAP 兩種形式。研究發現，IL1RAP在慢性粒細胞白血病干細胞上表達顯著升高，在正常造血干細胞上不表達或低表達。IL-1信號傳導需要一型IL-1受體(IL-1RI)和IL-1受體輔助蛋白(IL-1RAP)作為受體配偶體。研究發現，IL1RAP已被證明可以改善膠原誘導的關節炎，主要由于其有效的抗炎特性、促血管生成和生長特性[15]。可溶性IL1RAP在人血清中檢測到，似乎通過增加IL1與sIL1R2結合的親和力來發揮IL1反調節作用[16]，而子宮內膜異位癥患者外周血中sIL1R2濃度降低[17,18]，可以推出人子宮內膜異位癥患者外周血中IL1RAP減少。白細胞介素-1β(IL-1β)在損傷感染時以及疾病過程中被合成釋放，介導炎癥反應，相當于一種促炎性的細胞因子，其具有大范圍的表達譜，大量的細胞都可以進行表達，當機體處于正常狀況下的時候，其通常不會表達，只有當機體發生炎癥的時候，在炎癥信號的刺激作用下，能夠將其進行快速的組合和分泌，在慢性炎癥和腫瘤的發展過程中起到了重要作用[19]。而IL1RAP存在于IL-1β負調控通道上，因此可以推斷，該基因與牛子宮內膜炎抗性可能存在著某種相關關系[23]。IL1RAP表達和中性粒細胞在負相關方向上運動[24]。研究顯示，患有子宮內膜炎的牛的中性粒細胞明顯提高(P<0.05)[4]。在反芻動物血液中，中性粒細胞占比很大(45%左右)，是對細菌進行的第一道防線的抵御，在炎癥產生以后，他們是首批進入炎癥區的細胞，由此可以判斷，在如子宮內膜炎等由細菌感染引起的疾病中，ILIRAP可以提高對其的抵抗能力，能夠成為牛對子宮內膜炎的抗性候選基因。

本試驗結果得出患子宮內膜炎奶牛子宮組織中IL1RAP mRNA以及蛋白相對表達量均顯著低于健康奶牛子宮組織中IL1RAP mRNA以及蛋白相對表達量，發現可能與子宮內膜炎的病理生理學有重要關聯。實際上，IL1RAP包含兩種形式，可溶性IL1RAP是IL-1的主要特異性抑制劑，并因此在促炎細胞因子的下調中起重要作用，導致炎癥效應[25-27]。IL1RAP較低的循環水平可能與子宮內膜炎病理生理學中的可溶性IL1RAP表達缺乏相關，導致IL1介導的炎癥的反調節機制顯著缺乏[25,27-29]。

3 結 論

患子宮內膜炎奶牛子宮組織中IL1RAP的mRNA以及蛋白相對表達量比健康牛子宮組織中的相對表達顯著降低，為證明IL1RAP為奶牛子宮內膜炎的抗性基因提供支撐。