適于海島棉指紋圖譜構建的SNP核心位點篩選與評價

李樂晨 朱國忠 蘇秀娟,2 郭旺珍,*

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適于海島棉指紋圖譜構建的SNP核心位點篩選與評價

李樂晨1朱國忠1蘇秀娟1,2郭旺珍1,*

1南京農業大學作物遺傳與種質創新國家重點實驗室/ 雜交棉創制教育部工程研究中心, 江蘇南京 210095;2新疆農業大學農學院, 新疆烏魯木齊 830052

海島棉具有纖維品質好、抗病性強等優異性狀, 不僅為紡織工業提供優質棉纖維原料, 也是陸地棉相關性狀改良的重要供體材料。然而, 與陸地棉相比, 開展海島棉的遺傳多樣性和基因分型研究相對較少。本研究基于CottonSNP80K芯片對282份不同來源的海島棉品種/材料進行基因組SNP分型研究, 以選擇高效鑒別海島棉材料的核心位點組合。按照檢出率大于95%、具多態性、最小等位頻率(MAF)大于0.01、雜合率小于0.05、無冗余位點等條件篩選, 獲得2594個高質量SNP位點。對上述位點設置不同數目梯度篩選, 確定最優核心位點數。隨著位點個數的增多, 位點組合對海島棉材料的識別率逐漸增加。當位點數為200時, 識別率為89%; 位點數提高到1500時, 識別率可達99%。進一步增加位點數, 識別率無顯著變化。利用中選的1500個SNP位點檢測供試材料, 其平均MAF值0.14, 平均雜合率0.007, 平均多態信息含量0.21。SNP位點的聚丙烯凝膠電泳驗證表明, SNP-PCR與芯片分型結果一致性達98.3%。本研究提供了適于海島棉指紋圖譜構建、含1500位點的一套核心SNP位點組合, 可用于海島棉遺傳多樣性分析和品種身份鑒定。

基因芯片; DNA指紋圖譜; SNP; 海島棉

中國是世界上最大的棉花生產國之一, 植棉歷史悠久[1]。棉花屬于錦葵科()棉屬(), 分為52個種, 包括非洲棉(,2= 26, A1)、亞洲棉(, 2= 26, A2)、陸地棉(, 2= 52, [AD]1)和海島棉(, 2= 52, [AD]2) 4個栽培種。海島棉也稱長絨棉, 原產于中美洲、南美洲和加勒比地區。20世紀50年代, 海島棉被引入中國, 在河南、江蘇、新疆等地進行實驗種植[2]。20世紀80年代后, 海島棉主要在新疆地區種植。相較于陸地棉, 海島棉種植面積小, 占世界棉花產量的5%左右[3], 但其纖維優質細長, 以海島棉織造的衣服有極佳的觸感及良好的透氣性與吸汗力, 是生產高檔或特殊棉紡織品的首選[4]。此外, 海島棉還具有耐寒、耐旱、抗病和抗蟲等其他重要性狀[5], 常常被作為改良陸地棉農藝性狀和提高抗性的供體親本。

中國的海島棉主要種植在新疆塔里木盆地和吐魯番盆地[6]。自20世紀50年代海島棉引種成功后, 育種家一直致力于引種、系統選擇、雜交育種等新品種培育研究, 選育出勝利1號、軍海1號、新海系列等海島棉品種50余個, 有效服務了海島棉生產與市場需求, 也積累了較豐富的海島棉種質資源[7-8]。然而, 在育種實踐中, 對海島棉種質資源遺傳多樣性研究不多, 針對不同來源的種質資源不能有效區分; 由于少數骨干親本使用, 新育成品種相對早期品種遺傳多樣性降低; 也存在“套牌”、亂雜現象, 阻礙了海島棉產業發展。制定科學、可靠的品種鑒定方法和標準, 開展海島棉品種鑒定, 具有重要的科學和生產意義。

基于分子標記技術進行棉花品種鑒定及遺傳多樣性分析, 在陸地棉中已有深入研究[9-10], 而海島棉品種/材料的基因分型及指紋圖譜構建進展相對緩慢。幾個代表性報道集中在利用SSR/SRAP標記進行不同來源海島棉材料遺傳多樣性分析。潘兆娥等[11]利用SSR分子標記對來自俄羅斯、埃及、美國、阿爾巴尼亞、中國等的56份海島棉種質進行遺傳多樣性分析。李金榮等[12]利用SSR標記對14個新疆自育海島棉品種進行了聚類分析。李武等[13]利用SRAP標記, 對我國引入海島棉以來培育的36個國內品種及20個國外品種進行遺傳多樣性分析。上述研究揭示出海島棉種質資源總體上遺傳多樣性豐富, 但中國培育的海島棉品種遺傳基礎較為狹窄, 品種間平均相似系數較高。在大范圍品種鑒定過程中, 低通量的分子標記技術具有較大局限性。

近年來, 海島棉基因組序列解析及應用取得顯著進展。南京農業大學結合海島棉和陸地棉F2分離群體重測序分析, 構建含4,999,048個SNP位點, 覆蓋4042 cM的超高密度SNP和SSR整合海陸遺傳圖譜, 并成功用于四倍體陸地棉基因組組裝及scaffolds方向及順序確定[14]。基于全基因組測序分析, 溢達集團和華中農業大學分別公布了海島棉新海21及3-79的基因組框架信息[15-16]。這些研究為進一步篩選適宜于海島棉不同基因型鑒定的高多態SNP位點, 用于遺傳多樣性分析和品種身份鑒定奠定基礎。

本研究選擇不同來源的282份海島棉品種/材料, 利用實驗室自主研發的高密度棉花SNP芯片(CottonSNP80K)[17]開展基因分型研究。通過分析不同SNP位點遺傳多樣性信息, 篩選出一套高效用于海島棉品種/材料身份鑒定的SNP位點集合。該研究是我室基于全基因組篩選完成適于陸地棉品種身份鑒定的SNP核心位點組合后[18], 提供的適于另一個栽培四倍體棉種海島棉身份鑒定的SNP核心位點組合。該研究為開展海島棉遺傳多樣性分析、品種確權和保障育種者和消費者權益提供支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

海島棉品種/材料共282份(附表1)。其中16份早期國外引進品種和中國自育品種由中國農業科學院棉花研究所國家棉花種質中期庫提供, 其余266份由新疆農業大學農學院蘇秀娟收集自交保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取和質量檢測 取新鮮的棉花嫩芽約0.1 g置1.5 mL離心管中, 采用CTAB法提取基因組DNA[19]。分離出的DNA經1%瓊脂糖凝膠電泳, DNA條帶明亮且單一, 表明DNA濃度高且沒有被降解。同時借助超微量分光光度計(One Drop-OD 1000)進一步檢測DNA的質量和濃度, OD260nm/OD280 nm在1.8~2.0之間代表DNA純度較高, 按照所示DNA濃度將每一樣品濃度均一化至100 ng μL–1。

1.2.2 SNP位點篩選 供試材料的SNP檢測與數據分析方法同朱國忠等[18]。經CottonSNP80K芯片掃描的原始數據導入GenomeStudio軟件(V2011.1, Illumina, Inc.)進行SNP分型。根據SNP位點特性確定篩選條件(位點檢出率大于95%, 最小等位基因頻率大于0.01, 雜合率小于0.05)獲得位點組合。進一步利用位點篩選工具LociScan_V1.0對中選位點進行梯度篩選, 基于R對不同梯度位點之間進行相關性分析, 統計分析評價不同位點組合鑒定效率。LociScan_V1.0位點篩選軟件由北京市農林科學院玉米研究中心提供。

1.2.3 SNP結果驗證 隨機選取12個核心位點進行位點真實性驗證。利用WebSNAPER (https://pga. mgh.harvard.edu/cgi-bin/snap3/websnaper3.cgi)進行SNP特異引物設計, 引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。隨機選取芯片檢測具有多態性的材料進行引物多態性的初步篩選, 利用篩選獲得的多態引物進一步檢測10份不同來源的材料, 評價芯片的分型準確率。設計作為內標對照, 檢測不同樣本模板PCR擴增結果, 確保模板濃度的相對一致性。檢測的SNP-PCR反應程序為95℃預變性5 min; 95℃變性30 s, 58℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 循環數為28; 72℃延伸10 min。擴增產物經非變性PAGE電泳(恒壓200 V, 1.00~1.25 h), 通過銀染DNA顯帶, 記錄多態性數據。比較聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結果與芯片分型結果, 計算其一致性。

2 結果與分析

2.1 SNP位點特性評估

利用本研究室研發的高密度SNP芯片(Cotton SNP80K)[17]對282份不同來源的海島棉品種/材料進行基因分型。基于分型結果進行位點檢出率、雜合率和多態性評估。CottonSNP80K中包含77,774個有效的SNP位點。通過對282份品種/材料的位點檢測結果分析發現, 芯片中完全未檢出的SNP位點有225個, 占0.3%; 檢出率大于0.95的有72,138個, 占92.8%, 其中檢出率為1的SNP位點有36,697個(圖1-A)。表明該芯片SNP位點對海島棉檢測效率高, SNP本身也顯示很好的穩定性和重復性。SNP位點雜合率評估表明, 90.7%的位點(70,565)雜合率均小于0.05; 有5679個位點的雜合率大于0.5, 占7.3% (圖1-B)。這些位點的高雜合率可能是由于異源四倍體棉花A、D亞基因組間部分同源位點干擾造成。在77,774個SNP位點中, 有34,635 (44.5%)個SNP位點具有多態性。其中最小等位基因頻率(minor allele frequency, MAF)大于0.01的位點有10,369個, 占30.7% (圖1-C)。這可能是由于海島棉和陸地棉具有獨立進化和馴化特征[20], 而該芯片主要側重于陸地棉種內基因分型開發, 對海島棉的基因型多態性分型效率比陸地棉低。

圖1 77,774個SNP位點特性評估

橫坐標代表被統計的SNP特征參數, 依次為位點檢出率(call frequency)、雜合率(heterozygosity)和最小等位基因頻率(minor allele frequency), 縱坐標代表SNP的分布數目。

The abscissa represents statistical SNP characteristic parameters, including loci call frequency, heterozygosity, and minor allele frequency. The ordinate represents the number of SNPs.

2.2 核心SNP位點篩選和指紋圖譜構建

基于對CottonSNP80K中77,774個SNP位點的特性評估, 確定用于基因型分型的位點篩選條件。(1)篩選檢出率大于95%的SNP位點, 共72,138個; (2)篩選MAF大于0.01的位點, 獲7498個; (3)篩選雜合率小于0.05的位點, 余3245個; (4)去除基因型相同的位點, 獲2594個位點。利用2594個SNP位點組合, 其基因型檢出率為99.3%, 其中, 815個位點MAF大于0.2。

用LociScan_V1.0位點篩選工具對2594個位點進行分層篩選。分別設置200、300、400、500、1000、1500、2000、2500共8種不同數量位點, 進行識別效率信息統計。在200~1500位點時, 隨著位點個數的增多, 識別效率增加。當位點為200時, 識別率為89%; 當位點為1500時, 識別率為99%。當位點超過1500時, 識別率增長趨于平緩, 都穩定在99%以上(表1)。對8種不同位點組合基于R進行相關性分析(圖2), 8種不同位點組合兩兩之間值都小于0.001, 表明具有極顯著的線性相關。其中, 1500、2000和2500位點組合其相互間線性相關性最高。因此, 選擇1500位點作為適于海島棉指紋圖譜構建的核心SNP位點組合。

表1 核心位點的分層篩選

利用1500個SNP位點組合檢測282份供試材料, 其平均MAF值0.14, 平均雜合率0.007, 平均多態信息含量0.21, 99%以上的海島棉材料能被有效區分。本研究分別選擇3組來自中國農業科學院棉花研究所國家棉花種質中期庫和新疆農業大學自交保存的同名材料, 即3-79、Pima 1和新海5號, 進一步評估核心SNP位點組合的分辨力。結果表明, 不同來源的3-79基因型一致性為82.30%, 其17.70%的異質性中, 97.3%由純合SNP位點差異造成; 不同來源的Pima 1基因型一致性為84.19%, 其15.81%的異質性中, 99.58%由純合SNP位點差異造成; 不同來源的新海5號基因型一致性為91.67%, 其8.33%的異質性中, 22.13%由雜合SNP位點差異造成。同名海島棉材料, 在不同單位、不同環境種植保存中, 由于天然突變或異交會導致基因型變化, 通過自交保存, 遺傳變異進一步穩定。基于核心SNP位點組合可有效鑒定親緣關系相近的材料間遺傳差異及穩定性。

2.3 核心SNP位點準確性驗證

為驗證核心SNP位點的準確性, 分別從海島棉四倍體A、D亞組中各隨機挑選6個SNP位點開發特異性SNP引物, 并選擇10份海島棉材料進行基于PCR-PAGE電泳檢測SNP位點多態性和芯片分型結果一致性的驗證分析。結果顯示, 芯片分型結果與SNP-PCR一致性高達98.3% (表2和圖3), 進一步證明這些核心SNP位點的可利用性和基于芯片SNP分型的準確性。

3 討論

海島棉具有纖維品質好、抗病等優異性狀, 是高檔和特種棉紡織品的重要原料, 同時, 作為優異的供體材料, 被廣泛用于陸地棉纖維品質、抗性等性狀改良。南京農業大學以陸地棉遺傳標準系TM-1和海島棉海7124為親本, 通過回交和分子標記輔助選擇構建了一套陸地棉背景的海島棉染色體片段漸滲系。進一步選育出背景單一、優質、抗病性表現突出的漸滲系材料, 用于改良陸地棉品種的纖維品質和黃萎病抗性[21]。中國最早種植的海島棉, 是從埃及、美國、前蘇聯、蘇丹、秘魯等國引種, 進一步系統選育和雜交育種, 自主培育出的[22]。其中, 從“2依3”天然變異株中系選培育的“勝利1號”是中國第一個長絨棉品種[23]。從“9122依”天然變異單株中系選培育的“軍海1號”是中國長絨棉生產歷史上種植時間最長、推廣面積最大的海島棉品種[23]。“軍海1號”也是新疆海島棉育種的重要基礎種質, 后續選育的“新海”系列品種很多均有“軍海1號”的系譜, 也導致其遺傳相似性較高[23]。為有效區分不同海島棉品種, 鑒定其純度和真實性, 本研究選擇282份不同來源的海島棉品種/材料, 利用CottonSNP80K芯片進行全基因組SNP分型分析, 獲得一套適于構建海島棉材料指紋圖譜的SNP核心位點組合, 從DNA水平上為海島棉遺傳多樣性分析和材料鑒定提供依據。DNA指紋圖譜是指通過品種間的差異有效鑒別不同品種的圖譜, 具有多位點性、高變異性和穩定的遺傳性。利用分子標記技術開展棉花品種鑒定, 在陸地棉上已有系統深入的研究[9]。近年來, 基于基因組序列信息解析, SNP標記被廣泛用于品種遺傳多樣性分析和品種身份鑒定。孫正文等[24]利用CottonSNP63K芯片篩選出393個基因組特異的SNP位點。朱國忠等[18]利用CottonSNP80K芯片, 篩選出含4857個SNP位點, 高效鑒定陸地棉品種身份的核心SNP位點組合。與陸地棉相比, 基于全基因組的海島棉遺傳多樣性分析和品種身份鑒定相關研究還較缺乏。潘兆娥等[11]利用SSR標記對56份海島棉進行遺傳多樣性分析, 兩兩之間相似系數位于0.6~0.8之間。吳大鵬等[25]利用SSR標記對4個不同國家20份海島棉進行遺傳多樣性分析, 相似系數在0.66~0.94之間。這些研究表明, 育種進程中, 海島棉遺傳基礎狹窄, 多數品種之間相似系數偏高, 品種資源的同質化現象日趨嚴重。此外, 來源于不同單位不同環境種植的同名海島棉材料, 表現不同程度的異質性。因此, 不同來源的海島棉材料需要進一步從基因組水平上明確其遺傳多樣性和穩定性, 為海島棉種質資源有效利用提供依據。

圖2 核心位點分層篩選的相關性分析

對角線提供了不同位點下遺傳距離的分布; 下三角形(對角線的左下方)是不同類型SNP位點兩兩間的散點圖, 顯示出不同位點條件下的線性相關程度; 上三角形(對角線的右上方)數字表示不同類型SNP位點兩兩間的相關系數, ***表示在0.001水平顯著相關。

The diagonal gives the distribution of genetic distances at different loci. The lower triangle (the lower left of the diagonal) is a scatter plot between the two types among different SNP loci combinations, which shows the degree of linear correlation under different loci combinations conditions. The upper triangle (the upper right of the diagonal) represents the correlation value between the two types among different SNP loci combinations. *** means the significance at the 0.001 level.

表2 SNP位點信息及驗證結果

(續表2)

SNP標記SNP marker染色體Chr.位置Position (bp)不匹配數目Unmatched No.引物Primer (5￠-3￠) TM58458D05527011300F: TTTTTATCTTTAAGGTCGCCGCATGTGACR: ACCGATTGATTTTAAAGTTCCAAAAGAGAAGTTTG TM73511D1064546040F: GGGCACCTATCTTCTCTACACCTAACCCTTGR: AGAGCCAAACAAATGCACCAAATAGGGT TM80347D1354109371F: ATCTATTCCCTTTTTGACCTTCTCGACCAAAR: AAAACAACACTGTTTCAGGTAAAAGCTGACCA TM80357D1354644130F: TGACATGTGTTTGACATATTTGGATATGGATCTGR: AATGAAACCAATTTTAAAAGACCAATGCCTAAAGA Ghhis3D034814901F: CGGTGGTGTGAAGAAGCCTCATR: AATTTCACGAACAAGCCTCTGGAA

圖3 基于SNP-PCR技術驗證SNP位點芯片分型結果

M: DNA marker;: 內標對照; 1: 塔海901; 2: AW2046; 3: 農科10; 4: K339; 5: C6020; 6: K146; 7: 農科A16; 8: 司605; 9: 6--20; 10: AW2026。

M: DNA marker;: internal control; 1: Tahai 901; 2: AW2046; 3: Nongke 10; 4: K339; 5: C6020; 6: K146; 7: Nongke A16; 8: Si 605; 9: 6--20; 10: AW2026.

品種鑒定結果的可靠程度主要依賴于分子標記的穩定性和多態性[26], 使用低通量分子標記進行海島棉品種鑒定, 效率不高。隨著高通量測序和芯片技術的發展, 挖掘高質量SNP位點組合為海島棉品種遺傳多樣性及身份鑒定提供了有效途徑。本研究通過CottonSNP80K芯片篩選獲得了2594個高效鑒別海島棉材料的SNP位點, 且利用其中1500個位點即可對供試海島棉材料達到99%的識別率。這套SNP核心位點組合是用于海島棉指紋圖譜構建和身份鑒定的首次報道, 將為海島棉遺傳多樣性分析、品種身份鑒定和種質資源評價與利用提供技術支撐。

SNP指紋圖譜的構建方式也與SNP檢測分型技術相關, SNP檢測分析方法有很多種。以凝膠電泳檢測為基礎的檢測技術, 包括等位基因特異性PCR[27]和單鏈構象多態性[28], 具有檢測效率高、成本低的優勢, 已廣泛使用。該技術主要通過在正向引物的3￠端引入錯配堿基設計等位基因特異引物, 從而降低變異位點的產物擴增效率。由于模板濃度、擴增循環數、退火溫度、錯配堿基數目和類型以及不同SNP位點的側翼序列等因素影響, SNP-PCR擴增會產生部分非特異性擴增產物。Drenkard等[29]通過大量的擬南芥SNP擴增分析, 發現超過1000倍的模板濃度差異和10個PCR循環數差異會對部分非特異等位基因的擴增效率產生較大影響, 同時SNP旁側序列會影響等位基因特異引物設計。本研究通過控制相同模板濃度和統一PCR程序獲得有效區分SNP位點的引物。在相同PCR擴增條件下, 使用內標檢測不同模板PCR擴增結果, 以確保模板濃度的相對一致性。此外, 本研究也選擇2個SNP位點(TM20245, TM53439)在多態性樣本材料中進行測序驗證, 證實該SNP多態位點在不同海島棉材料中存在的真實性。基于上述結果, 盡管部分SNP-PCR引物會產生低擴增效率的PCR產物, 在PCR-PAGE電泳檢測時顯現較弱的擴增條帶, 但在檢測條件一致的情況下, 特異性強帶和非特異性弱帶易于區分, 不影響檢測結果的真實性。

隨著技術發展, 基于直接測序法、基因芯片技術[30]和競爭性等位基因特異性PCR[31]等檢測方法已有效用于高通量的SNP分型研究。本實驗核心位點的梯度篩選分析表明, 200個SNP位點就可以達到89%的識別率, 對于親緣關系較遠的海島棉品種, 可以選用這200個SNP位點集合, 使用KASP或定點測序對其身份鑒定; 對于親緣關系較近的品種, 需要采用高密度SNP位點集合結合基因芯片技術高通量鑒定, 本研究報道的含1500位點的SNP組合可用于其特異性分析。隨著海島棉基因組測序和重測序研究的進一步開展, 未來可以結合新的SNP數據進一步改進和完善, 形成高效繪制海島棉指紋圖譜的位點組合。

4 結論

基于CottonSNP80K芯片的分型結果, 綜合考慮位點多態性、雜合率、準確性、高通量等參數, 篩選出適于海島棉指紋圖譜構建、含1500位點的一套核心SNP位點組合, 可實現海島棉品種及資源材料的身份鑒定。

附表 請見網絡版: 1) 本刊網站http://zwxb.china-crops.org/; 2) 中國知網http://www.cnki.net/; 3) 萬方數據http://c.wanfangdata.com.cn/Periodical-zuowxb. aspx。

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Genome-wide screening and evaluation of SNP core loci for fingerprinting construction of cotton accessions ()

LI Le-Chen1, ZHU Guo-Zhong1, SU Xiu-Juan1,2, and GUO Wang-Zhen1,*

1State Key Laboratory of Crop Genetics & Germplasm Enhancement, Hybrid Cotton R&D Engineering Research Center (the Ministry of Education), Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, Jiangsu, China;2College of Agronomy, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, Xinjiang, China

Sea-island cotton (), characterized by its extra-long staple (ELS), strong and fine fibers, and disease resistance, provides important natural fiber for textile industry, also key donor for improving agronomic traits of upland cotton. However, compared to, there are few studies on genetic diversity and genotyping in. To obtain the SNP core loci for fingerprinting construction of sea-island cotton accessions, we performed SNP genotyping within 282 accessions using the CottonSNP80K array. A total of 2594 high-quality SNP loci were obtained based on the selective criteria of call frequency for each locus > 0.95, loci with polymorphism, minor allele frequency (MAF) > 0.01, heterozygosity rate < 0.05, and the removal of same genotype. Further, the number of optimized core loci was screened by gradients analysis. With the number of loci increasing, the discrimination ability of the sea-island cotton accessions increased gradually. When the loci were 200, the recognition rate was 89%, and when the number of the loci increased to 1500, the recognition rate was 99%. When the loci were further increased, no significantly improved recognition rate was detected. Based on the detection using the 1500 core loci combination, the average MAF value was 0.14, the average heterozygosity rate was 0.007, and the average polymorphism information content was 0.21. The polyacrylamide gel electrophoresis for the core SNP loci verified the consistency as high as 98.3% between SNP-PCR and chip genotyping. This study provides a set of core SNP loci suitable for constructing fingerprinting of sea-island cotton accessions, which can be used for genetic diversity analysis and fingerprinting identification of sea-island cotton.

gene array; DNA fingerprint; SNP; sea-island cotton

2018-09-20;

2019-01-12;

2019-02-19.

10.3724/SP.J.1006.2019.84123

郭旺珍, E-mail: moelab@njau.edu.cn

E-mail: 2017101076@njau.edu.cn

本研究由國家重點研發計劃項目(2017YFD0102000)和江蘇現代作物生產協同創新中心(No. 10)項目資助。

This study was supported by the National Key R&D Program for Crop Breeding (2017YFD0102000) and Jiangsu Collaborative Innovation Center for Modern Crop Production Project (No.10).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190218.0903.002.html