LDL與Raw264.7細胞中腎素-血管緊張素系統表達

劉南 章程 武舒佳 武軍駐(通訊作者)

（武漢大學基礎醫學院生物化學及分子生物學系 湖北 武漢 430071）

動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是心血管系統中最常見的，威脅我國人民健康的慢性疾病[1]，在發達國家其發病率和死亡率也很高[2]。AS是受損動脈的病變是從內膜開始的。LDL參與了AS的病變過程，LDL的氧化在慢性炎癥反應中起著極其重要的作用[3-5]。血管緊張素（Angiotensin，Ang)是腎素-血管緊張素系統（RAS）中的多肽，可使血管收縮，進而導致血壓升高。至今為止，4種血管緊張素肽（AngI、AngII、AngIII和AngIV)和四種血管緊張素受體(AT1、AT2、AT3和AT4)已經被鑒定[6]。無活性的AngI通過血管緊張素轉換酶（ACE）轉化為AngII。AngII代謝為AngIII，而后通過兩種氨肽酶轉化為AngIV。AngII和AngIII是AT1和AT2受體的完全激動劑。AngII是最有效的效應因子，通過調節血容量，血壓，外周血管張力，在維持心血管系統的穩態中起重要作用[7-8]。但AngⅡ與LDL氧化之間的相互作用關系尚不清楚，本研究旨在探究LDL氧化過程中對腎素-血管緊張素系統的影響，為研究AngⅡ與LDL氧化之間的相互作用關系提供一定的依據。

1.材料與方法

1.1 主要試劑

實驗室保存有Raw264.7巨噬細胞，LDL購自ProSpec-Tany公司。AT2R抗體來源于Abcam公司，GAPDH抗體來源于美國EarthOx公司。小鼠血管緊張素轉化酶（ACE）試劑盒、小鼠血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）試劑盒購自上海仁捷生物科技有限公司。

1.2 細胞培養

小鼠RAW264.7細胞培養在含1%青霉素-鏈霉素，10%胎牛血清，90%DMEM的完全培養基中，置于5% CO2，90% 濕度，37℃的恒溫培養箱中培養。

1.3 LDL處理

Raw264.7細胞達到80%-90%細胞密度時，換成無血清和雙抗的DMEM培養基中同步化過夜，加入LDL（終濃度100μg/ml,含終濃度1μM的Cu2+），在培養箱中孵育不同的時間。用RIPA裂解液裂解細胞，離心取上清。

1.4 小鼠血管緊張素轉化酶（ACE）試劑盒測定

ACE的活性 收集LDL刺激的細胞裂解后的上清，設置標準品孔和樣本孔，分別加入對應的標準品和樣品，空白孔不加；每孔加入檢測抗體-HRP，空白孔除外；37℃孵育60min。洗滌液清洗5遍，每孔加入底物A和B，37℃避光孵育15min。每孔加入終止液，15min 內，在450nm 波長處測OD值。以測得標準品的OD值和濃度值繪制標準曲線，得到直線回歸方程，將ACE的OD值代入方程，計算出ACE的活性。

1.5 小鼠血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）試劑盒測定AngⅡ的表達

收集LDL刺激的細胞裂解后的上清，設置標準品孔和樣本孔，分別加入對應的標準品和樣品，空白孔不加；每孔加入檢測抗體-HRP，空白孔除外；37℃孵育60min。洗滌液清洗5遍，每孔加入底物A和B，37℃避光孵育15min。每孔加入終止液，15min 內，在450nm 波長處測OD值。以測得標準品的OD值和濃度值繪制標準曲線，得到直線回歸方程，將AngⅡ的OD值代入方程，計算出AngⅡ的含量。

1.6 Real-Time PCR檢測ACE mRNA的表達

提取細胞總RNA，設計β-actin上游引物為5'-CTCCATCCTGGCCTCACTGT-3'；下游引物為5'-GCTGTCGCCTTCACCGTTCC-3'， 設 計ACE上 游引物為5'-TACAACTCCAGCGCCGAAC-3',下游引物為5'-GCCAGATCGGTTCATACAGC-3'；逆轉錄42℃ 2min，37℃ 15min，85℃ 5sec。隨后上機進行Real-Time PCR檢測。結果處理：相對定量 2–ΔΔCt法。ΔCt（對照組）= Ct（對照組目的基因）- Ct（對照組內參基因），ΔCt（實驗組）= Ct（實驗組目的基因）-Ct（實驗組內參基因），ΔΔCt=ΔCt（實驗組）-ΔCt（對照組）。

1.7 Real-Time PCR檢測

AT2R mRNA的表達 提取細胞總RNA，β-actin引物同上；設計AT2R上游引物為5'-ACAGGATAACCCGTGACCAAG-3'，下游引物為5'-ACACTGCGGAGCTTCTGTTG-3'；逆轉錄42℃ 2min，37℃15min，85℃ 5sec。隨后上機進行Real-Time PCR檢測。結果處理：相對定量 2–ΔΔCt法。

1.8 Western Blot檢測AT2R的表達

將LDL刺激細胞后的裂解上清進行SDS-PAGE，180mA橫流轉膜2h，脫脂牛奶封閉2h，一抗4℃搖床孵育過夜。TBST洗滌3次，每次15min。二抗室溫孵育2h后，TBST洗滌3次，每次10min。加ECL顯影，隨后用軟件掃描灰度值分析條帶。

1.9 統計學分析

用SPSS軟件分析數據，計量資料用均數±標準差表示，運用Graphpad Prism5作圖，用t檢驗P＜0.05為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 LDL刺激使ACE活性升高

LDL處理Raw264.7 0、5、10、15min，用ACE試劑盒測定ACE的活性變化：與對照組相比，酶的活性在刺激后5min（1.3667±0.1457，P＜0.05）、15min（1.3767±0.1401，P＜0.05）增高（圖1）。

圖1.LDL刺激Raw264.7細胞0、5、10、15min后ACE的活性變化n＞3,*P＜0.05

2.2 LDL刺激使AngⅡ表達升高

LDL處理Raw264.7 0、1、3、5、7、9、12h，試劑盒測定AngⅡ的表達：與對照組（797.6±12.46），相比，刺激后AngⅡ1h（952.5±21.28，P＜0.05）、7h（969.63±20.82，P＜0.05）表達升高（圖2）。

圖2 LDL刺激細胞0、1、3、5、7、9、12h后AngⅡ的表達變化n＞3,*P＜0.05

2.3 LDL刺激Raw264.7細胞后檢測ACE mRNA的表達

LDL處理Raw264.7細胞0、1、3、5h：與對照組相比，刺激后3h ACE mRNA的表達升高（1.2533±0.1405，P＜0.05）,5h下降（0.7000±0.1100，P＜0.05）（圖3）。

圖3.LDL刺激細胞0、1、3、5h后ACE mRNA的表達變化n＞3,*P＜0.05

2.4 LDL刺激Raw264.7細胞后檢測AT2R mRNA的表達

LDL刺激Raw264.7細胞0、1、3、5h：與對照組相比，刺激1h（2.805±1.006，P＜0.05）、5h（3.6700±1.0934，P＜0.05）后AT2 mRNA表達升高（圖4）。

圖4.LDL刺激細胞0、1、3、5h后AT2RmRNA的表達變化n＞3,*P＜0.05

2.5 Western Blot檢測AT2R的表達

LDL刺激Raw264.7細胞0、1、3、5h后，檢測AT2R的表達：AT2R蛋白表達升高，3h（2.5967±0.7253，P＜0.05）、5h（2.5933±0.6886，P＜0.05）升高約2.6倍（圖5）。

圖5.LDL刺激細胞0、1、3、5h后AT2R的表達變化n＞3,*P＜0.05

3.討論

研究表明，AngⅡ參與了AS的病理生理過程，血管緊張素II誘導的高血壓會加重ApoE-小鼠中AS的發展[9]。LDL的氧化過程是一個多因子參與的過程，早期的研究已經表明人體注射血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）后血壓的升高與血清 LDL 水平密切相關。近期研究發現AngⅡ會促進LDL聚集[10]。因此AngⅡ和LDL之間應該存在相互作用。

在本實驗中，在LDL刺激5-15min內ACE的活性提高，從而使AngⅡ的含量在1h后也升高，因此LDL可以促進AngⅡ的表達；并且ACE mRNA、AT2 mRNA與蛋白表達都升高，說明LDL能激活RAS。因此天然LDL粘附于細胞被氧化成oLDL的過程中，血管緊張素轉移酶（ACE）被激活，使AngⅡ表達升高，進一步LDL促進了ACE mRNA和AT2受體的表達，說明LDL激活了腎素-血管緊張素系統。

我們推測天然LDL氧化過程中，AngⅡ可能作為識別標簽，通過識別受體AT1、AT2，介導細胞對LDL的氧化。本實驗可作為AngⅡ與LDL相互作用的部分依據，后面會繼續研究AngⅡ作用于LDL的方式，檢測AngⅡ與LDL的相互作用方式，探究LDL氧化的分子機制。