原發性肝癌癌組織腫瘤抑制因子候選基因1表達與病理特征的關系

王媛 惠雙 張成輝 郭宏強

原發性肝癌屬常見惡性腫瘤，有報道稱其發生為一個多基因共同參與的復雜過程，涉及肝細胞損傷修復、抑癌基因、腫瘤基因等，其中腫瘤抑制基因在抑制腫瘤發生過程中起著重要作用[1]。近年有資料顯示，腫瘤抑制因子候選基因1(Tumor suppressor candidate 1，TUSC1)作為一種新型抑癌基因，在甲狀腺乳頭狀癌、乳腺癌中呈低水平表達，且其表達水平較正常組織低[2]。而在原發性肝癌中，TUSC1 mRNA及其蛋白表達與臨床病理特征的相關性鮮有報道。本研究納入78例原發性肝癌患者，進行回顧性分析，旨在深入探討原發性肝癌癌組織中TUSC1表達與病理特征的關系，現報道如下。

資料與方法

一、一般資料

納入2016年10月至2018年10月于我院收治的78例原發性肝癌患者為對象，進行回顧性分析，獲我院醫學倫理委員會批準。納入標準：①與《原發性肝癌規范化病理診斷指南(2015版)》[3]中原發性肝癌診斷標準相符，經病理學確診；②年齡≥18歲，首次發??；③獲患者知情同意。排除標準：①合并心、肺、腎等重要器官疾??；②伴其他部位惡性腫瘤者；③入組前1周接受放化療、介入治療、分子靶向藥物治療、微波消融等抗腫瘤治療；④伴重度肝硬化所致肝功能嚴重異常，或腹水、黃疸明顯者。按TUSC1 mRNA檢測結果，將78例患者分為TUSC1 mRNA表達組(55例)及缺失組(23例)；按TUSC1蛋白檢測結果，將其分為TUSC1蛋白表達組(45例)及缺失組(33例)。

二、 方法

(一)TUSC1基因mRNA表達檢測 取患者60 mg癌組織，剪碎研磨，加入TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)1 mL，TRIzol法提取樣本總RNA，行RNeasy Mini Kit純化。以超微量分光光度計(Nanodrop 2000型，北京百道亨儀器設備有限公司)測定RNA濃度和A260/A280吸光度比值(確保在1.8～20.0之間)。依據基因序列，行β-actin肌動蛋白(β-actin)、TUSC1基因引物序列設計(見表1)。以β-actin基因為內參，實時熒光定量聚合酶鏈反應體系：總體積、內含模板分別為25 μL、2 μL，上下游引物均為0.5 μL，TaKaRa Taq HS 0.25 μL，10聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)緩沖液5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸混合物4 μL，其余補水25 μL。取5 μL PCR產物，采用瓊脂糖凝膠電泳方法，以2%瓊脂糖凝膠、100V電壓電泳30 min，行反應產物檢測，后采用Quantity-One圖像分析(成都百樂科技有限公司)，計算樣本TUSC1表達水平。2720型PCR基因擴增儀購自孚約安防設備(上海)有限公司，實時熒光定量聚合酶鏈反應試劑盒由美國Thermo公司生產；TUSC1、β-actin引物序列由美國Abmart公司合成。

表1 PCR引物設計

(二)TUSC1蛋白表達檢測方法 取25 μg蛋白，使用20 g/L十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(晶美生物工程有限公司)，行電泳處理。半于法轉膜后使用50 g/L脫脂奶粉(南京松冠生物科技有限公司)室溫封閉60 min，將1∶1 000的1Tris-HCl緩沖液稀釋的TUSC1一抗及1∶5 000的內參β-actin一抗加入其中。4 ℃過夜后以Tris-HCl緩沖液洗膜3次，將1∶5 000的1Tris-HCl緩沖液稀釋的二抗加入其中，室溫60 min。1Tris-HCl緩沖液洗膜3次，暗室內行增強型化學發光試劑(上海紀寧實業有限公司)顯影，曝光。以Quantity-One生物醫學圖像分析系統對TUSC1蛋白表達量進行計算。

三、觀察指標

比較患者癌組織及癌旁組織中TUSC1 mRNA及其蛋白表達水平，分析其臨床病理特征與癌組織中TUSC1 mRNA及其蛋白表達的關系，并觀察TUSC1 mRNA表達與TUSC1蛋白表達的一致性。

四、統計學方法

結 果

一、 原發性肝癌癌組織及癌旁組織中TUSC1 mRNA及其蛋白表達比較

原發性肝癌癌組織中TUSC1 mRNA及其蛋白表達水平顯著低于癌旁組織(P<0.05)，見表2。

表2 原發性肝癌癌組織及癌旁組織中TUSC1 mRNA及其蛋白表達比較

二、原發性肝癌病理特征與TUSC1 mRNA表達的關系

TUSC1 mRNA表達與原發性肝癌患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤直徑、腫瘤類型、HBsAg無明顯關系(P>0.05)，但早期(TNM分期為Ⅰ、Ⅱ期)者TUSC1 mRNA陽性表達率顯著低于中晚期(Ⅲ、Ⅳ期)者(P<0.05)，高、中分化者TUSC1 mRNA陽性表達率顯著低于低、未分化者(P<0.05)，肝內轉移者TUSC1 mRNA陽性表達率顯著高于肝內無轉移者(P<0.05)，伴門靜脈癌栓者TUSC1 mRNA陽性表達率顯著高于不伴門靜脈癌栓者(P<0.05)。見表3。

三、原發性肝癌病理特征與TUSC1蛋白表達的關系

TUSC1 蛋白表達與原發性肝癌患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、腫瘤類型、HbsAg無明顯關系(P>0.05)，但中晚期(TNM分期為Ⅲ、Ⅳ期)者TUSC1蛋白陽性表達率顯著高于早期(Ⅰ、Ⅱ期)者(P<0.05)，高、中分化者TUSC1蛋白陽性表達率顯著低于低、未分化者(P<0.05)，肝內轉移者TUSC1蛋白陽性表達率顯著高于肝內無轉移者(P<0.05)，伴門靜脈癌栓者TUSC1蛋白陽性表達率顯著高于不伴門靜脈癌栓者(P<0.05)。見表4。

表3 原發性肝癌病理特征與TUSC1 mRNA表達的關系(例數，%)

四、原發性肝癌患者TUSC1 mRNA表達與其蛋白表達的一致性分析

原發性肝癌患者TUSC1 mRNA表達與TUSC1蛋白表達具有良好一致性(kappa為0.56)，見表5。

表4 原發性肝癌病理特征與TUSC1蛋白表達的關系(例數，%)

表5 原發性肝癌患者TUSC1 mRNA表達與其蛋白表達的一致性分析

討 論

TUSCI已被證實與多種惡性腫瘤的發生、發展、侵襲、轉移有關，其功能喪失及癌基因激活已成為癌變的分子基礎。TUSCI基因屬新型抑癌基因，處于人類染色體9P21.2，是鎂離子轉運系統重要成員，其編碼的蛋白質為寡糖基轉移酶復合物中的亞基，在蛋白質折疊過程中的N端糖基化反應中發揮著重要作用。TUSC1突變缺失或異常表達可改變N端糖基化進程，而異常N端糖基化會誘發蛋白質錯誤折疊，出現內質網結構及功能異常改變，促使細胞轉化為惡性腫瘤細胞。趙愛國等[4]研究表明，TUSC1與癌癥之間關系密切，已在多種惡性腫瘤中發現 TUSC1表達降低或缺失，如甲狀腺乳頭狀癌、乳腺癌等。

本研究發現，與癌旁組織相比，原發性肝癌癌組織中TUSC1 mRNA及其蛋白呈低表達，可能與原發性肝癌的惡性進程有關。國外研究表明，TUSC1基因在人類許多腫瘤中存在低表達，而關于其在肝臟中表達的研究報道較少[5]。Rimkus等[6]報道TUSC1在乳腺癌中的表達明顯下調，TUSC1缺失可促進乳腺癌細胞增殖、轉移，而TUSC1缺失可能與TUSC1基因啟動子區過甲基化有關。陳皓等[7]認為TUSC1基因啟動子的甲基化為基因失活關鍵機制，與腫瘤惡性程度有關。本研究中，筆者認為TUSC1在原發性肝癌中的表達下調可能與TUSC1基因啟動子區過甲基化有關。一旦出現TUSC1基因啟動子區過甲基化，會抑制TUSC1基因轉錄，使TUSC1基因呈低水平表達，導致TUSC1基因解毒、抑癌功能減弱，提示TUSC1甲基化可能促進原發性肝癌發病進程，具體機制有待更大樣本進行深入研究。

本研究發現，TUSC1 mRNA及其蛋白表達與TNM分期、分化程度、門靜脈癌栓、肝內轉移有關，提示TUSC1表達下調可進一步增加原發性肝癌侵襲性、增殖能力及惡性程度，與患者腫瘤惡性進展程度有關。夏琬君等[8]報道通過檢測65例浸潤性乳腺癌癌組織中啟動子甲基化及蛋白表達，發現癌旁組織未出現TUSC1基因啟動子甲基化，對應乳腺癌組織中甲基化水平占61.5%；而癌旁組織TUSC1蛋白均有明顯表達，對應乳腺癌組織出現蛋白表達占29.2%，證實甲基化發生率與蛋白表達與TNM分期、淋巴結轉移明顯相關，表明TUSC1基因啟動子甲基化為基因失活關鍵機制，與乳腺癌發病有關。本研究發現，患者TUSC1 mRNA表達與TUSC1蛋白表達具有良好一致性，提示TUSC1 mRNA陽性表達者多伴有TUSC1蛋白陽性表達。

綜上，癌組織TUSC1 mRNA及蛋白的聯合檢測是原發性肝癌的有效診斷手段，可早期評估原發性肝癌肝內是否存在轉移，判斷是否合并門靜脈癌栓，臨床上應引起足夠重視。但本研究由于樣本量偏小，未涉及患者預后與TUSC1表達間的關系，故今后仍需深入調查研究。