CCl4誘導(dǎo)肝纖維化小鼠模型中肝臟巨噬細胞及淋巴細胞亞群變化的初步分析

唐穎悅 李靜 雷曉紅 李春敏 曾民德 茅益民

慢性肝臟炎癥導(dǎo)致的肝纖維化、肝硬化在全球每年造成超過100萬人死亡[1]。盡管肝星狀細胞(HSC)激活是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，但在肝纖維化的發(fā)生和進程中有多種細胞參與，包括肝實質(zhì)細胞、肝竇內(nèi)皮細胞、巨噬細胞(庫普弗細胞)、淋巴細胞等。如庫普弗細胞分泌的TGFβ1、血小板衍生生長因子(PDGF)和腫瘤壞死因子(TNF-α)等是HSC激活的關(guān)鍵，其分泌的IL-4和IL-13可直接刺激MFB的膠原合成[2]；T淋巴細胞主要亞群Th1細胞分泌的細胞因子(如IFN-γ和IL-12)能抑制肝纖維化，而Th2分泌的IL-13可促進膠原合成[3]；NKT細胞分泌大量細胞因子包括IFNγ和IL-4，對肝纖維化的進展具有雙向作用[4]。NK細胞可殺傷活化早期的HSC和衰老的肌纖維母細胞，顯著抑制肝纖維化[5]。B細胞缺失可減少膠原的沉積并通過抗體不依賴途徑緩解肝纖維化發(fā)展[6]。本研究通過多色流式技術(shù)觀察CCl4誘導(dǎo)肝纖維化模型中各免疫細胞的變化，探討其可能參與的調(diào)節(jié)機制。

材料與方法

一、 實驗動物

雄性C57BL/6小鼠，10～12周齡，購于上海斯萊克動物實驗中心。所有實驗小鼠均飼養(yǎng)于上海睿太莫斯生物科技有限公司實驗動物中心，SPF級獨立通風(fēng)籠，自由飲食。

二、 主要試劑及儀器

CCl4購于國藥集團上海化學(xué)試劑有限公司；橄欖油購于上海生工生物工程有限公司；Percoll購于德國GE Healthcare(40501ES60)；紅細胞裂解液購于上海翊圣生物科技有限公司(40401ES60)；RPMI1640購于美國Gibco；流式細胞抗體均購自美國Biolegend。流式細胞儀購自美國BD公司(BD LSRFortesssa X20)；全自動脫水機、石蠟包埋機、脫蠟機均來自于德國Leica公司。

三、動物分組及模型建立

14只雄性C57BL/6小鼠隨機分成2組，每組7只。在適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型，實驗組小鼠予腹腔注射20% CCl4溶液(1 mL/kg)，每周2次，持續(xù)6周；對照組小鼠予腹腔注射橄欖油(1 mL/kg)，實驗期間自由飲水，飼養(yǎng)溫度控制在(24±2)℃，濕度為(50±5)%，每天換水和墊料，每周稱量體質(zhì)量。在末次注射CCl448 h后對實驗組和對照組小鼠進行安樂死，并收集外周血和肝臟樣本。

四、HE、Masson染色,肝纖維化病理評分

肝組織4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋并切片。HE染色：肝組織石蠟切片二甲苯脫蠟,酒精梯度濃度脫水,蘇木素染色30 s、水洗30 s，1%鹽酸酒精3 s、水洗30 s、1% 氨水30 s,伊紅染色1 min,二甲苯透明和中性樹膠封片。Masson染色：肝組織石蠟切片二甲苯脫蠟，酒精梯度濃度脫水，酸性麗春紅品紅染色1 min，放入0.2%冰醋酸3 s，1%磷鉬酸10 s，0.2%冰醋酸3 s，0.2%冰醋酸1 s，梯度酒精脫水，二甲苯透明并中性樹膠封片。按照Metavir分級標準將肝臟纖維化分為5期：F0為無肝纖維化；F1為輕度肝纖維化；F2為顯著肝纖維化或明顯肝纖維化；F3為進展期肝纖維化；F4為肝硬化。

五、流式細胞分析

小鼠肝臟沖洗干凈，取出并研磨，將細胞進行離心、沖洗，用Percoll分離液分離，棄上清后加紅細胞裂解液離心，用RPMI1640細胞培養(yǎng)液重懸調(diào)整計數(shù)細胞為106/mL,制成肝臟單細胞懸液備用。取肝臟單細胞懸液100 μL, 分別加入FITC anti-mouse CD3(17A2)、APC anti-mouse/human CD45R/B220(RA3-6B2)、PE/Cy7 anti-mouse NK-1.1(PK136)、APC anti-mouse CD206 (MMR)(C068C2)、Brilliant Violet 605TManti-mouse CD11c(N418)、Brilliant Violet 421TManti-mouse F4/80(BM8)、Zombie NIRTMFixable Viability Kit各1.5 μL 輕柔混合,4℃孵育30 min后加入 PBS 洗滌2次,上機檢測，用FlowJo軟件進行后期數(shù)據(jù)分析。

六、統(tǒng)計學(xué)方法

采用 SPSS 16.0進行統(tǒng)計學(xué)分析,采用Graph Pad Prism 7.0進行繪圖，計量資料采用均數(shù)±標準差表示。兩組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、構(gòu)建CCl4誘導(dǎo)肝纖維化疾病模型

對照組小鼠肝臟表面呈紅色，質(zhì)地柔軟且富有彈性(圖1A)，而實驗組小鼠肝臟略小且質(zhì)硬，表面呈灰黃色，散布大小結(jié)節(jié)(圖1B)。HE染色可見對照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)和肝細胞形態(tài)正常，未見明顯肝纖維化(圖1C)；而實驗組小鼠肝小葉纖維明顯增多，正常肝小葉減少，多數(shù)被假小葉替代，網(wǎng)狀纖維(假小葉)內(nèi)可見炎細胞彌漫性浸潤，肝細胞排列紊亂且出現(xiàn)彌漫散在的脂肪變性(圖1D)。Masson染色可見實驗組小鼠肝臟纖維化沉積明顯重于對照組，平均病理評分達到F3(圖1E、1F)。

與對照組小鼠相比，實驗組小鼠體質(zhì)量明顯下降(P<0.05)，同時肝濕重相對下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。實驗組小鼠外周血ALT及AST顯著高于對照組(P<0.001)，在血脂方面，實驗組TG和LDL-C均顯著上升(P<0.05)，TC高于對照組，而HDL-C低于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

圖1 對照組和實驗組小鼠肝臟肉眼觀、HE以及Masson染色圖像(100)

二、 CCl4模型小鼠肝臟巨噬細胞亞群比例變化

圖2A所示為多色流式細胞術(shù)分析巨噬細胞亞群的邏輯策略圖。如圖2B所示，實驗組F4/80+巨噬細胞比例高于對照組，數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示實驗組巨噬細胞比例達到(13.33±1.91)%，而對照組僅為(8.17±2.00)%，(P<0.001)(圖2C)。進一步分析巨噬細胞亞群的比例發(fā)現(xiàn)，實驗組小鼠肝臟中存在大量M1型巨噬細胞，而對照組小鼠肝臟中M1型細胞比例則維持在一個較低的水平；兩組中主要發(fā)揮抑制炎癥作用的M2型巨噬細胞比例均較低(圖2D)。統(tǒng)計結(jié)果表明，以CD11c+標記M1型細胞在實驗組小鼠中達到了(24.19±3.07)%，明顯高于對照組的(12.67±4.69)%，(P<0.01)(圖2E)；以CD206+標記M2型細胞比例在兩組間則無明顯變化(圖2F)。提示在CCl4誘導(dǎo)肝纖維化小鼠疾病模型中，大量巨噬細胞浸潤肝臟組織，且主要是以促炎作用為主的M1型巨噬細胞。

三、 CCl4模型小鼠肝臟淋巴細胞亞群比例變化

圖3A所示為多色流式細胞術(shù)分析淋巴細胞亞群的邏輯策略圖。如圖3B、3C、3D所示，實驗組小鼠肝臟CD3+T淋巴細胞比例(20.17±4.07)%與對照組(36.00±4.61)%相比明顯下降(P<0.01)，而CD45R+B淋巴細胞比例在兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。同時，如圖3E、3F、3G所示，實驗組小鼠肝臟中NK-1.1+CD3+NKT細胞比例較對照組明顯降低；而兩組間NK-1.1+NK細胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義。由此我們認為在肝纖維化疾病模型中肝臟局部定植的T細胞和NKT細胞的比例出現(xiàn)明顯下降，而B細胞和NK細胞則沒有發(fā)生明顯改變。

討 論

肝臟免疫細胞參與肝纖維化的進展。Karlmark等[7]觀察到長期CCl4刺激會導(dǎo)致肝內(nèi)CD11b+F4/80+細胞比例明顯升高。針對慢性肝損傷和纖維化患者的研究也發(fā)現(xiàn)，這些患者體內(nèi)巨噬細胞數(shù)量明顯增多[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，慢性肝纖維化小鼠的肝臟組織中庫普弗細胞比例明顯升高，并且以M1型巨噬細胞為主，實驗組M1型巨噬細胞的比例明顯高于對照組，但是M2型巨噬細胞的比例在兩組間并無顯著差別。有研究指出，M1型巨噬細胞分泌促炎因子如IL-1β、INF-γ、MCP-1和TNF-α，加重肝臟損傷。肝損傷后大量庫普弗細胞活化可通過NF-κB信號通路啟動TGF-β、TNF-α等細胞因子的合成和分泌，進而激活HSC，加快肝纖維化發(fā)展[9]。巨噬細胞的分化還會影響肝纖維化環(huán)境下T細胞亞群的構(gòu)成比，主要影響Th1介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。與此同時，HSC活化后分泌趨化因子如CCL3, CCl4, CXCL1, CXCL2或者CXCL10，可通過TLR4依賴的信號途徑促進單核巨噬細胞的向肝臟組織的趨化作用。

肝纖維化晚期會出現(xiàn)T淋巴細胞和NKT細胞比例明顯降低，這一變化將加速CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化。

表1 對照組和實驗組小鼠一般情況、生化指標、肝纖維化評分比較(±s)

注：與對照組相比，*P<0.05，***P<0.001

圖2 對照組和實驗組小鼠肝臟巨噬細胞及其亞型檢測結(jié)果

多項研究發(fā)現(xiàn)，肝硬化患者外周血中T淋巴細胞數(shù)量減少，疾病晚期表現(xiàn)更明顯。因此，本研究分析了CCl4誘導(dǎo)慢性肝纖維化小鼠肝臟局部組織中T細胞、B細胞、NK細胞和NKT細胞的分布情況。與對照組相比，實驗組小鼠肝臟組織中，T細胞和NKT細胞比例均明顯降低，這與患者中觀察到的現(xiàn)象相似。但是，兩組間B淋巴細胞和NK細胞比例并無顯著變化。以上結(jié)果提示，在肝纖維化晚期T細胞和NKT細胞的比例降低，可能會加速體內(nèi)免疫功能失衡，促進肝纖維化的發(fā)生和進展。

綜上，在CCl4誘導(dǎo)慢性肝纖維化小鼠模型中，肝臟內(nèi)以M1型細胞為主的庫普弗細胞浸潤明顯，而局部浸潤的NKT細胞和T細胞比例則明顯減少，提示M1型巨噬細胞可能在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，且可能成為肝纖維化治療的潛在靶點。因此，后續(xù)可以針對M1型巨噬細胞在肝纖維化中的作用機制開展更深入的研究。

圖3 對照組和實驗組小鼠肝臟T、B、NK、NKT淋巴細胞檢測結(jié)果