CCL23在肝細胞癌中的表達及其對預后的影響

汪建業 趙之聰 侯嘉杰 夏強

趨化因子在多種生物學過程中發揮著重要作用，例如白細胞轉移、免疫應答、細胞遷移和細胞增殖等[1，2]。近年來，趨化因子在肝癌中的作用受到廣泛關注，它們一方面可以募集免疫細胞增強免疫反應發揮抗腫瘤作用，另一方面也可以促進腫瘤的增殖、遷移和侵襲。CCL23(又稱MPIF-1，MIP-3或CKβ-8)基因位于染色體17q12，最早是從人主動脈內皮細胞和人單核細胞系THP-1中發現的，在多種組織中表達，包括闌尾，結腸和膽囊等。它通過受體CCR1對單核細胞、樹突狀細胞和T淋巴細胞具有趨化活性，并對粒-單核系祖細胞的增殖具有抑制作用[3-5]，但CCL23在惡性腫瘤中的作用鮮有報道。本研究從公用數據庫中篩選出在肝癌和癌旁肝組織中表達差異明顯的CCL23，通過實時熒光定量PCR及免疫組織化學法進一步驗證CCL23在肝癌組織中的表達。

資料和方法

一、基于肝細胞癌的數據分析

通過GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)檢索并下載公共肝癌芯片數據(GSE14520，GSE25097，GSE57957，GSE57958，GSE64041)，TCGA-LIHC數據庫獲取(http://tcgadata.nci.nih.gov)374例肝癌及50例正常肝組織基因表達譜，通過Perl語言生成“基因表達矩陣文件”，并分析相關基因變化。

二、臨床樣本選取及隨訪

收集2014年2月至2016年2月上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院的196例行根治性肝切除術的肝癌患者組織標本及臨床病理資料，并制作肝癌組織芯片。另外隨機選擇82個HCC組織標本，同時選取配對的癌旁正常組織標本。肝癌組織選擇：①術前臨床診斷為原發性肝癌及術后病理確診為肝細胞肝癌；②臨床病理資料完整；③癌旁正常組織距肝癌組織>2 cm。④排除非腫瘤原因死亡者。術后以門診和電話形式進行隨訪，從手術日開始計算存活時間和無復發存活時間。

三、免疫組織化學

將組織芯片脫蠟，水合，通過檸檬酸鹽抗原修復溶液(用PBS稀釋)在微波條件下修復，CCL23單克隆抗體(英國Abcam公司，ab171751)以1∶100稀釋，并用1%BSA稀釋為陰性對照，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔的二抗(購自美國Jackson公司)以1∶200稀釋。染色評估：使用Image pro plus 軟件讀取圖像IA值，并根據IA值來評價肝組織中的CCL23的表達強度。

四、實時熒光定量聚合酶鏈反應

隨機選擇82對癌與癌旁組織。根據Biotech RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，并反轉錄成互補的脫氧核糖核酸(cDNA)。Nanodrop 2000分光光度計(Thermo Scientific，美國)測量RNA濃度及純度，并根據SYBR Green I Master Mix方案，反應體系10 μL，β-actin作為內參進行實時熒光定量PCR。 PCR：95℃ 5 min; 95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，40個循環; 95℃，5 s，65℃，1 min。引物序列為： CCL23正向引物：5′-CATCT-CCTACACCCCACGAAG-3′，反向引物：5′-GGGT-TGGCACAGAAACGTC-3′；β-actin正向引物：5′-GGGAAATCGTGCGTGACAT-TAAG-3′，β-actin反向引物：5′-TGTGTTGGCGTA-CAGGTCTTTG-3′。

五、統計分析

使用GraphPad Prism 7.0或SPSS 23.0軟件進行統計學分析。配對t檢驗用于分析肝癌及癌旁組織中CCL23表達的差異，Kaplan-Meier和Log-rank檢驗用于生存分析，單因素和多因素Cox回歸模型用于分析CCL23表達水平對于預后的影響，卡方檢驗用于分析CCL23表達水平與臨床病理學特征之間的關系。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、不同趨化因子在肝癌中的表達

為了篩選出在肝癌發展中起重要作用的趨化因子，研究了GSE25097隊列以及TCGA中所有趨化因子基因的表達譜，將配對肝癌和癌旁的表達譜進行差異表達分析，結果顯示，與正常組織相比，GSE14520及TCGA數據庫中分別有35、38種趨化因子基因表達發生顯著下調。見表1。在這兩個隊列中，除去CXCL14后(其在數據庫中對患者總體預后影響并不明顯)，CCL23的差異倍數(foldchange, FC)及差異的顯著性變化都最為明顯(TCGA：FC=0.132873932,P值=2.31217E-88; GSE25097：FC=0.130784185,P值=1.15E-72)。

二、CCL23在公共數據庫中的表達、與臨床病理相關性及患者預后的關系

進一步驗證隊列(GSE57957，GSE64041)發現CCL23在肝癌組織中的表達普遍下調(所有數據經標準化處理)(圖1 A)。在TCGA以及GSE14520隊列中，將患者分為高表達和低表達組，并繪制Kaplan-Meier曲線，結果提示，CCL23高表達組的總體生存率(TCGA：P=0.0026，GSE14520：P=0.0014)(圖2 B)和無復發生存率(TCGA：P=0.0306，GSE14520：P=0.0189)(圖1 C)均顯著延長。其與臨床病理指標構建四個表并做卡方檢驗發現，肝癌中的CCL23表達水平僅與腫瘤數目(P=0.019)明顯相關。此外，在GSE14520隊列中，通過單因素及多因素分析發現，CCL23表達水平(P=0.002)、肝硬化(P=0.020)和BCLC分期(P<0.01)是總生存時間的影響因素，而CCL23表達水平(P<0.01)和性別(P=0.024)是影響肝癌患者無瘤生存時間的影響因素。見表2，3。

表1 公共數據庫中趨化因子基因差異表達

三、CCL23在肝癌患者中的表達及與患者預后的關系

通過qRT-PCR對82例肝癌及配對癌旁組織中進一步驗證CCL23 mRNA的表達水平，結果顯示肝癌組織中CCL23表達明顯低于癌旁組織(P<0.01)(圖2 A)。此外，通過免疫組織化學染色發現，在已有的70對癌和癌旁肝組織芯片中，CCL23陽性強度明顯高于癌旁組織(圖2 D)。根據染色強度，將肝癌組織中CCL23分為高表達(n=97)和低表達(n=99)兩組，結果顯示，CCL23高表達者的總生存時間和無瘤生存時間上都明顯優于CCL23低表達的患者(P<0.01)(圖2 B&C)；與各項臨床病理指標構建四格表并做卡方檢驗發現，肝癌中的CCL23表達水平與病理分級(P=0.003)明顯相關，而與年齡、性別、HBV、腫瘤大小甲胎蛋白、腫瘤數目、ALT、衛星病灶及肝硬化無關(表4)。另外，將各項病理指標分別做單因素COX回歸分析，然后將差異有統計學意義的指標納入多因素COX回歸分析發現，肝癌組織中CCL23水平(P=0.002)、腫瘤大小(P<0.01)、腫瘤數目(P=0.005)和甲胎蛋白(P=0.041)是影響肝癌患者術后總生存時間的獨立危險因素，而CCL23水平(P<0.01)、腫瘤大小(P<0.001)和甲胎蛋白(P=0.015)是影響肝癌患者術后無瘤生存時間的獨立危險因素(表5)。

表2 GSE14520中CCL23和臨床病理學特征之間的相關性

注：A.在公共數據庫中，CCL23在肝癌與癌旁組織中的差異；B.在 TCGA-LIHC隊列； C.GSE14520隊列中，肝癌組織中CCL23表達與患者預后的關系

圖1CCL23在公共數據中的表達及與患者預后的關系

注：A.82例肝癌患者中，CCL23在肝癌與癌旁組織中的差異； B和C.肝癌組織中的CCL23高表達與患者預后的關系； D.CCL23在肝組織中的免疫組織化學染色(左：肝癌組織；右：配對癌旁組織：左上：肝癌組織中的CCL23低表達患者；左下：肝癌組織中CCL23高表達患者，放大倍數：200倍)

圖2 CCL23在肝癌患者中的表達及與患者預后的關系

注：NA為未被采納

表4 HCC中CCL23和臨床病理學特征之間的相關性

討 論

目前已經在多種疾病中發現趨化因子的重要作用，尤其是在肝癌的發生發展過程中。例如，Zhang等[6]分析人肝癌的預后生物標志物的微陣列發現，CCL14明顯下調，并且對肝癌細胞增殖有影響。Wang等[7]通過分析TCGA數據庫發現多個趨化因子是肝癌預后的獨立危險因素，其中XCR1對肝癌患者預后影響最顯著。此外，在肝癌的發生發展中，趨化因子配體-受體的相互作用發揮著重要作用，例如CXCL12-CXCR4/CXCR7可以促進肝癌的增殖[8，9]，CX3CL1-CX3CR1可抑制肝癌細胞的增殖[10]，CCL20可以增強肝癌細胞的增殖和轉移能力等[11]。

本研究首先在GSE14520隊列探討各個趨化因子在肝癌及癌旁組織中的表達水平，然后在其他公共數據庫中驗證發現，CCL23的表達差異最為顯著。已知CCL23可以特異性募集靜息T淋巴細胞和單核細胞、抑制髓系祖細胞增殖、促進血管形成，還可以負性調節人臍帶血CD34+細胞的增殖等[12]。本研究證實了CCL23在肝癌組織中表達明顯下調，其表達水平與腫瘤數目及病理分級相關，提示其可能參與腫瘤細胞的分化和增殖，其中高表達者的總生存時間及無瘤生存時間顯著延長，表明CCL23可能抑制肝癌的發生發展。此外，CCL23與其受體CCR1結合，可以募集單核細胞，樹突狀細胞和T淋巴細胞，并且可通過CCR1誘導內皮細胞遷移和血管生成，但CCL15-CCR1軸可增強肝癌細胞的轉移[13]、CCL3-CCR1軸可促進肝癌細胞增殖和侵襲[14]，表明在肝癌中CCL23可能不是主要通過CCR1發揮作用。綜上所述，趨化因子CCL23可以作為肝癌術后遠期生存復發的預測指標，為今后的肝癌治療靶點提供理論基礎。

表5 HCC中CCL23的單因素和多因素Cox回歸分析