基于二茂鐵標記的電化學(xué)DNA生物傳感器研究*

朱濟鋒， 王國東， 周大明， 王赟姣， 梁麗媛, Chaker TLILI

(1.河南理工大學(xué) 電氣工程與自動化學(xué)院，河南 焦作 454150；2.河南理工大學(xué) 物理與電子信息學(xué)院，河南 焦作 454150；3.中國科學(xué)院 重慶綠色智能技術(shù)研究院精準醫(yī)療單分子診斷中心，重慶 400700)

0 引 言

近年來，發(fā)展檢測特異性脫氧核糖核酸(DNA)的生物傳感裝置引起了廣大科研工作者的興趣[1～3]。在過去的幾十年里，已開發(fā)出多種DNA生物標志物的檢測技術(shù)，如聚合酶反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)[4]、微陣列熒光技術(shù)[5]和比色測定[6]等。然而，這些技術(shù)由于存在過程耗時長、標記步驟繁瑣、價格昂貴等缺點，很難大規(guī)模推廣應(yīng)用。較之傳統(tǒng)的檢測方法，電化學(xué)生物傳感器不僅靈敏度高、選擇性好、成本低廉，還具有小型化的前景，非常適合規(guī)模化生產(chǎn)，是公認的最有前景的生物標志物快速檢測方法[7]。目前，基于電化學(xué)的無指示劑DNA生物傳感器引起了廣泛關(guān)注和研究興趣，這類傳感器通過鍵合在DNA探針上的電活性基團電化學(xué)信號的變化，實現(xiàn)對目標的快速、靈敏檢測。

幾十年來，基于電化學(xué)的DNA生物傳感器已在疾病診斷、基因測序、食品安全、環(huán)境檢測等領(lǐng)域開展了大量的基礎(chǔ)研究，但在穩(wěn)定性、選擇性和可重復(fù)性方面仍面臨一定的挑戰(zhàn)，限制了其在臨床診斷中的大規(guī)模應(yīng)用。

本文利用二茂鐵及其衍生物可逆性強、再生電位低且氧化還原態(tài)穩(wěn)定的特點[8,9]，在金電極上通過Au-S鍵自組裝方式固定巰基和二茂鐵修飾的DNA探針，構(gòu)建了基于二茂鐵為電子介體的具有重復(fù)性強、穩(wěn)定性和選擇性好的電化學(xué)DNA傳感器。

1 基本原理

傳感器的基本原理如圖1所示。首先，修飾有巰基和二茂鐵的DNA探針通過Au-S鍵在金電極表面自組裝形成均勻分布的目標DNA捕獲區(qū)，由于DNA探針上的二茂鐵與金電極表面距離較近從而產(chǎn)生一個相對較大的峰電流信號，當(dāng)加入目標DNA后，DNA探針與目標DNA雜化形成剛度較大的DNA雙鏈，從而使DNA探針尾端的二茂鐵遠離金電極表面，使得方波伏安法中的峰電流減小,構(gòu)建“tun-off”型電化學(xué)傳感器[10～12]。同時，有研究者指出“莖環(huán)形”DNA傳感器和“直線形”DNA傳感器在使用交流伏安(AC voltammetry,ACV)法、循環(huán)伏安(cyclic voltammetry,CV)法和差分脈沖(differential pulse voltammetry,DPV)法檢測時，由于掃描頻率的不同而出現(xiàn)由“tun-off”轉(zhuǎn)變?yōu)椤皌urn-on”型的DNA傳感器[13]。因此，本文重點考查了方波伏安法的掃描頻率對DNA傳感器的檢測靈敏度影響，優(yōu)化基于二茂鐵電子介體的電化學(xué)DNA生物傳感器性能。

圖1 生物傳感器原理

2 實 驗

2.1 儀器與試劑

本文電化學(xué)實驗均采用三電極系統(tǒng)：工作電極為金電極(直徑為2.0 mm),鉑絲為輔助電極，飽和Ag/AgCl作為參比電極。方波伏安法(square wave voltammetry,SWV)測定均使用CHI760E 電化學(xué)分析儀(上海辰華儀器有限公司)；實驗中所設(shè)計的不同序列DNA均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列如下：

探針Fc-DNA(3′-HS-C6-TTT-TTT-TTT-TAT-GGG-ACA-TCT-GGT-TTC-AAA-CAC-Fc-5′)

完全互補 cDNA (5′-TA-CCC-TGT-AGA-ACC-GAA-TTT-GTG-3′)

完全不互補ncDNA (5′-AT-AAT-CTC-GTG-TAT-ACC-AAA-TGT-3′)

2.2 金電極預(yù)處理

首先將金電極用砂紙打磨，然后分別使用1，0.3，0.5 μm的氧化鋁粉末對金電極進行拋光，直到電極表面光滑如鏡，并分別使用超純水和乙醇超聲清洗殘留的氧化鋁。然后在食人魚溶液(V(H2SO4)︰V(H2O2) =7︰3)中超聲清洗5 min后再用超純水清洗。將清洗后的電極放入0.1 mol/L硫酸溶液中使用電化學(xué)工作站在-0.2～2 V的電壓范圍內(nèi)以100 mV/s的速率連續(xù)掃描直到曲線穩(wěn)定。最后，使用超純水超聲清洗，并用高純氮氣吹干備用。

2.3 傳感器的制備

取二茂鐵和巰基修飾的探針Fc-DNA溶液(20 μmol/L)10 μL,加入20 μL的三(2—羧乙基)磷鹽酸鹽(TCEP,100 mmol/L)，和170 μL的Tris緩沖溶液(10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4；1 mol/L NaCl),在 37 ℃條件下反應(yīng)20 min激活DNA探針上的硫醇基團(SH)。然后將預(yù)處理過的裸金電極浸沒在上述Fc-DNA探針混合溶液中靜置過夜，使Fc-DNA探針在金電極表面自組裝形成均勻分布的目標DNA捕獲區(qū)。待Fc-DNA探針固定后，用超純水沖洗去除不穩(wěn)定的Fc-DNA探針，然后將電極浸沒在1 mmol/L的巰基乙醇(MCH)溶液中4 h以封閉金電極裸露表面，最后用Tris緩沖液沖洗可以得到DNA檢測傳感器。

2.4 電化學(xué)檢測

在室溫條件下，將修飾過Fc-DNA探針的傳感器分別與不同濃度的目標DNA反應(yīng)1 h。然后在三電極系統(tǒng)中，采用方波伏安法在磷酸緩沖溶液(10 mmol/L PBS，pH 7.4)中進行檢測，檢測電壓范圍為0.25～0.6 V，掃描頻率為200 Hz。通過對比DNA傳感器與目標DNA雜交前后，峰電流的變化率ΔIP/I0(%)來檢測目標DNA的濃度，其中，ΔIP=I0-IP,I0為未加入目標DNA前金電極的峰電流，IP為加入目標DNA后金電極的峰電流。

3 結(jié)果與討論

3.1 金電極電化學(xué)表征

圖2 金電極電化學(xué)表征

3.2 頻率分析

在方波伏安法中當(dāng)掃描頻率遠低于二茂鐵電子介體傳輸速率時，峰電流與頻率成正比。如圖3(a)所示，當(dāng)掃描頻率在低于200 Hz時，不同掃描頻率的峰電流呈線性關(guān)系，在DNA雜化之前，其線性擬合公式為Is=0.040 7+3.903 4f,Is為DNA雜化前的峰電流，f為掃描頻率，線性相關(guān)系數(shù)為0.989 7。在DNA雜化后，其線性擬合公式為ID=0.040 7+3.903 4f,ID為DNA雜化后的峰電流，f為掃描頻率，線性相關(guān)系數(shù)為0.88。而當(dāng)施加的頻率接近臨界值時，電子轉(zhuǎn)移無法跟上快速振蕩的電位，峰電流相對于背景電流減小。如圖3(b)所示， 當(dāng)掃描頻率高于200 Hz 時，雜化前的峰電流相對于雜化后的峰電流的變化率減小[13]。

圖3 頻率分析

所以，在本文中選取最佳的掃描頻率200 Hz進行方波伏安法檢測。

3.3 檢測性能

為了檢測制備的DNA傳感器性能，使用方波伏安法對不同濃度的目標DNA進行檢測，可以看出，隨著目標DNA濃度從0 nmol/L增加至100 nmol/L，峰電流逐漸降低，由于Fc-DNA探針與目標DNA雜化形成了剛度較大的DNA雙鏈，使得Fc-DNA探針末端修飾的二茂鐵遠離金電極表面，這與設(shè)計的檢測原理一致。在目標DNA雜化前后峰電流變化率ΔIP/I0(%)與目標DNA濃度線性關(guān)系中，誤差棒由3個獨立重復(fù)的實驗計算所得。峰電流變化的信號量與加入的目標DNA濃度在5.0×10-9～1.0×10-7mol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，其線性方程式為ΔIP/I0(%) =0.760 95+0.610 65c，ΔIP/I0(%)為峰電流的相對變化率，c為目標DNA的濃度，線性相關(guān)系數(shù)為0.993 54。采用3σ計算方式，其檢測限為1.7×10-9mol/L。

3.4 選擇性

在相同條件下，對100 nmol/L非互補DNA(ncDNA)和互補DNA(cDNA)進行了檢測，結(jié)果如圖4所示。從圖4(a)可以看出：當(dāng)ncDNA與DNA探針反應(yīng)后，由于兩個DNA單鏈無法互補，所以雜化后峰電流基本不變，當(dāng)與cDNA序列雜化后，由于符合堿基互補配對原則，形成了剛度較大的雙鏈DNA后將末端的電化學(xué)活性基團二茂鐵從金電極表面拉遠，使得峰電流下降，表現(xiàn)出明顯的響應(yīng)電流變化。從圖4(b)的峰電流變化柱狀圖可以看出，加入nc-DNA后其峰電流變化率為0.2 %，而相同濃度下的cDNA所引起的峰電流變化率為59.9 %，說明制備的電化學(xué)DNA生物傳感器擁有良好的選擇性。

圖4 選擇性測試

3.5 穩(wěn)定性與重現(xiàn)性

為了檢測所制備傳感器的穩(wěn)定性，將修飾過探針的DNA傳感器浸沒在Tris緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl，pH7.4；150 mmol/L NaCl；20 mmol/L MgCl2)中，在室溫條件下分別放置1,24 h后檢測其方波伏安曲線，其峰電流分別減小0.1 %和1.4 %，說明所構(gòu)建的DNA傳感器具有良好的穩(wěn)定性。

在相同的條件下，獨立構(gòu)建3支不同的DNA傳感器，在同等的條件下與100 nmol/L的互補DNA雜化反應(yīng)后，3支DNA傳感器的峰電流變化率依次為54 %，56.3 %，60 %，RSD為4.3 %，表明了良好的重現(xiàn)性。

4 結(jié) 論

本文構(gòu)建的傳感器利用Au-S鍵的自組裝作用，通過在DNA兩端分別標記二茂鐵和巰基，避免了繁瑣的修飾過程；通過對方波伏安法掃描頻率與峰電流信號之間關(guān)系的優(yōu)化，極大地提高了DNA電化學(xué)生物傳感器的檢測靈敏度和穩(wěn)定性。此外，該傳感器適合用于快速、靈敏的檢測特異性DNA，本文有望為后續(xù)的臨床早期診斷疾病中檢測變異的DNA序列提供理論依據(jù)和參考。