殼聚糖山苓祛斑凝膠的高效液相指紋圖譜*

陳軍，熊鑫，余南才

(武漢市第一醫院藥學部，武漢 430022)

殼聚糖山苓祛斑凝膠是由茯苓、白芷、白術、白芨、當歸、丁香等12味藥材組成，臨床上主要用于治療黃褐斑，為我院中醫部周利副主任醫師經驗方，具有活血行氣、祛斑養顏的功效，本方臨床使用多年，用于治療黃褐斑，療效確切。本方涉及多味中藥，化學成分較復雜，且還受各味藥材的產地、用藥部位和制備工藝的影響，僅以尿囊素、羥基紅花黃色素A的含量測定作為質量控制的方法，難以全面準確地反映該制劑的質量。而指紋圖譜能在一定程度上反映其質量的可控性、穩定性及真實性。質量控制方式及技術體系[1-7]能全面地反映制劑的內在特征。本實驗采用高效液相色譜(HPLC)法建立殼聚糖山苓祛斑凝膠的指紋圖譜檢測方法，為提高殼聚糖山苓祛斑凝膠的質量控制標準和全面的質量檢查提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters e2695高效液相色譜儀(紫外檢測器，四元泵，柱溫箱)，BP211D電子天平(德國賽多利斯公司，Max210g ，d=0.01mg)。

1.2試藥 歐前胡素(批號：110826-201616)、異歐前胡素(批號：110827-201611)、阿魏酸(批號：110773-201614)、丁香酚(批號：110725-201615)均購自中國食品藥品檢定研究院；殼聚糖山苓祛斑凝膠自制，批號分別為：20170510，20170512，20170520，20170525，20170527，20170601，20170603，20170605，20170610，20170613，甲醇為色譜純(美國TEDIA公司)，二氯甲烷、磷酸為分析純(天津市白世化工有限公司)，純化水自制。

2 方法與結果

2.1色譜條件 AgilentC18色譜柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)，流動相為甲醇(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0～10 min，25%A；>10～28 min，25%A→55%A；>28～45 min，55%A→85%A；>45～50 min，85%A→25%A)[8-14]，檢測波長286 nm，流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液制備 分別精密稱取減壓干燥至恒重的歐前胡素、異歐前胡素、阿魏酸、丁香酚對照品適量至量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，再分別精密移取上述對照品適量至同一量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液(歐前胡素123.5 μg·mL-1、異歐前胡素108.4 μg·mL-1、阿魏酸122.9 μg·mL-1、丁香酚96.6 μg·mL-1)。

2.2.2試品溶液制備 精密稱取本品(批號：20170510)5 g至燒杯中，加入純化水15 mL溶解后轉移至分液漏斗中，加二氯甲烷萃取3次，每次20 mL，合并二氯甲烷，水浴蒸干，殘渣用甲醇溶解并定容于25 mL量瓶中，經孔徑0.45 μm 微孔濾膜濾過，作為供試品溶液，備用[15-17]。

2.3方法學考察

2.3.1精密度實驗 取殼聚糖山苓祛斑凝膠(批號：20170510)，按“2.2.2”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件連續自動進樣6次進行測定，記錄色譜圖，以阿魏酸為參照峰，測得樣品各共有峰相對保留時間RSD<1.0%，相對峰面積RSD<3.0%，說明該儀器的精密度良好。

2.3.2穩定性實驗 取殼聚糖山苓祛斑凝膠(批號：20170510)，按“2.2.2”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件測定，分別于0，3，5，10，15，20 h自動進樣，記錄色譜圖，以阿魏酸為參照峰，測得樣品各共有峰相對保留時間RSD<2.0%，相對峰面積RSD<5.0%，表明供試品溶液在20 h內穩定性良好。

2.3.3重復性實驗 取同一批號(20170510)殼聚糖山苓祛斑凝膠，按“2.2.2”項方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項色譜條件測定，記錄色譜圖，以阿魏酸為參照峰，測得樣品各共有峰相對保留時間RSD<3.0%，相對峰面積RSD<5.0%，表明該方法的重復性良好。

2.4指紋圖譜的建立及分析

2.4.1指紋圖譜的建立 取10批殼聚糖山苓祛斑凝膠的供試品，分別按“2.2.2”項方法制備供試品溶液10份，按“2.1”項色譜條件測定，記錄色譜圖，將10批殼聚糖山苓祛斑凝膠的液相色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2010版)軟件進行評價，建立殼聚糖山苓祛斑凝膠的指紋圖譜[18-19]，并生成對照色圖譜R(圖1)。

圖1 10批殼聚糖山苓祛斑凝膠HPLC指紋圖譜及對照圖譜

Fig.1HPLCfingerprintandreferencefingerprintoftenbatchesofchitosanShanlingQubangel

2.4.2共有峰的標定及參照峰的選擇 對供試品溶液的色譜圖進行分析，標定了殼聚糖山苓祛斑凝膠中出峰時間穩定、特征明顯的10個共有峰為特征峰(圖2)，并確定了其中2，5，7，9號峰分別為歐前胡素、阿魏酸、異歐前胡素、丁香酚(圖3)。其中5號峰阿魏酸的保留時間居中，分離度好，峰面積大，易于辨認，故選為本品指紋圖譜的參照峰。

圖2 共有峰色譜圖

Fig.2Commonpeaksofthechromatogram

2.歐前胡素；5.阿魏酸；7.異歐前胡素；9.丁香酚

2.4.3指紋圖譜相似度評價 對10批殼聚糖山苓祛斑凝膠所測得的色譜圖采用國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2010版)軟件進行分析，進過數據匹配，以中位法建立指紋圖譜，得10批樣品和對照指紋圖譜的相似度均>0.9(表1)。并以5號峰阿魏酸為參照物，計算各共有色譜峰的相對保留時間和相對峰面積，見表2，3。

3 討論

3.1波長的選擇 本制劑中所含的大部分藥材在2015版《中華人民共和國藥典》及其他文獻均無或極少HPLC檢測方法，故選取白芷、當歸、柴胡、丁香、紅花等有HPLC法的幾味藥材來選定檢測波長，其中，柴胡和紅花的檢測波長分別為210和403 nm，紫外光吸收少，殼聚糖山苓祛斑凝膠樣品的整體峰吸收較差，不利于制劑指紋圖譜的采集，故參考文獻，選取白芷中歐前胡素、異歐前胡素、當歸中阿魏酸、丁香中丁香酚結合全波長掃描來選取檢測波長，其中286 nm處色譜峰信息豐富，基線平穩，特征峰明顯，故選取286 nm作為殼聚糖山苓祛斑凝膠指紋圖譜的檢測波長。

3.2流動相的選擇 本制劑考察了乙腈-磷酸、甲醇-磷酸等常用的指紋圖譜流動相系統，其中在甲醇-磷酸條件下，色譜峰峰型良好，特征峰多，并結合梯度洗脫，色譜峰分離度好，故選擇甲醇-磷酸作為殼聚糖山苓祛斑凝膠指紋圖譜的檢測流動相。

本實驗對10批殼聚糖山苓祛斑凝膠的指紋圖譜進行相似度計算，10批殼聚糖山苓祛斑凝膠的相似度、相對保留時間和相對峰面積均在合理的范圍內，表明殼聚糖山苓祛斑凝膠各批次成分間性質穩定，說明該制劑的制備工藝純熟，本實驗建立的殼聚糖山苓祛斑凝膠指紋圖譜方法簡單，易操作，可用于完善其質量標準的研究。

表1 10批殼聚糖山苓祛斑凝膠指紋圖譜相似度結果

表2 10批殼聚糖山苓祛斑凝膠共有峰的相對保留時間

表3 10批殼聚糖山苓祛斑凝膠共有峰的相對峰面積