Akt抑制劑MK2206對膀胱癌細胞增殖凋亡的影響

顏丹萍，馬頻

(湖北省丹江口市第一醫院藥學部，丹江口 442700)

絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(protein kinase B，PKB)，又名Akt蛋白[1]，是PI3K/Akt信號通路中的關鍵信號因子，能夠調控細胞的增殖、活化和代謝等諸多生理活動[2]。研究發現，Akt在諸多腫瘤細胞中均有過表達的情況，且Akt的異常表達與癌細胞的異常增生、活化有密切關系[3]。MK2206作為Akt小分子變構抑制劑，能夠抑制不同亞型的Akt因子，抑制肺癌細胞和卵巢癌細胞的增殖活化[4]。筆者在MK2206對其他惡性癌癥研究的基礎上，初步探討其對膀胱癌T24細胞增殖、凋亡的影響，為臨床上治療膀胱癌提供參考。

1 材料與方法

1.1細胞株 膀胱癌細胞(T24)由武漢大學人民醫院中心實驗室饋贈。

1.2試劑與試藥 MK2206(美國Selleck生物科技有限公司，貨號：S1078)；MEM培養基(美國Gibco 公司，貨號：SH30022.01B)；胎牛血清(四季青公司，貨號：P30-3302)；胰蛋白酶-EDTA消化液(美國Gibco公司)；二甲亞砜(DMSO，美國Signal公司)；聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)配制試劑盒、GAPDH一抗等均購自武漢谷歌生物科技有限公司，Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin(均按照1：1000稀釋)兔抗人一抗、羊抗兔二抗均購自美國Cell signaling technology 公司；流式細胞術凋亡試劑盒(PE-7AAD，美國BD公司)；CCK-8 試劑盒(日本同仁研究所)。

1.3儀器 超凈工作臺(蘇州集團安泰空氣技術有限公司)；CB150二氧化碳(CO2)細胞培養箱(德國Binder公司)；Victor 31420 Multilable Counter酶標儀(美國Perkin Elme 公司)；Heraeus Fresco 21低溫微量離心機(德國Themo 公司)；FACS AriaⅢ流式細胞儀(美國BD公司)；Odyssey 雙色紅外激光成像系統(美國 LI-COR 公司)。

1.4細胞培養 在溫度37 ℃、5%CO2培養箱中，于含10%胎牛血清，1%雙抗(100 U·mL-1青霉素、100 U·mL-1鏈霉素)的MEM培養液中培養T24細胞。待細胞長至90%時，胰酶消化，重懸細胞。按每2.5×105個細胞接種于6孔板，待生長對數期，棄去舊培養基，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次，給予含不同濃度MK2206的1%血清培養基，培養24 h后提取總蛋白。

1.5CCK-8法檢測不同濃度MK2206對T24細胞增殖的影響 收集T24細胞制備單細胞懸液，按照每孔1.5×104個細胞接種至96孔板中。待細胞達生長對數期，棄去舊培養基，PBS洗滌1次，加入含不同濃度的MK2206的1%血清培養液(終濃度分別為0，1，5，10，20 μmol·L-1)[5]，每組設6個復孔。37 ℃、5%CO2培養箱中分別培養24，48，72 h后，每孔加10 μL CCK-8，37 ℃培養箱中孵育30～60 min，酶標儀在450 nm處測定各孔吸光度(A)值。細胞存活率(%)=(實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.6Western blotting法測定MK2206對細胞內蛋白表達的影響 MK2206作用24 h后將各組培養皿置于冰上，加入PIPA裂解液收集細胞，于4 ℃下12 000×g離心25 min，取上清液，BCA法測蛋白濃度，其余的加入loading buffer在100 ℃變性5～10 min，-20 ℃保存備用。

按SDS- PAGE凝膠配制試劑盒配制10%分離膠和5%濃縮膠，取每組蛋白50 μg上樣，電泳1.5 h，將蛋白轉至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上電轉1.5 h。5%BSA封閉2 h，TBST洗滌，兔抗人一抗(Akt、p-Akt、GSK-3β、β-catenin、GAPDH)稀釋液中4 ℃孵育過夜。洗滌，PVDF膜至羊抗兔二抗中，室溫搖床上孵育1.5 h，洗滌，利用Odyssey成像系統掃膜分析，檢測各組細胞內目的蛋白與內參條帶的灰度值，計算二者比值。

2 結果

2.1CCK-8法檢測不同濃度MK2206對T24存活率的影響 CCK-8實驗結果表明，MK2206能夠顯著抑制T24細胞的增殖活力，且呈濃度-時間依賴性，見圖1。該抑制劑處理時間在24，48，72 h時的半數抑制濃度(IC50)值分別為14.11，3.21，0.76 μmol·L-1。且相同處理時間下，在0～20 μmol·L-1濃度范圍內，隨著MK2206濃度的增加，抑制效果明顯增加(P<0.05)，而當達到最大濃度20 μmol·L-1時，處理時間不是抑制T24細胞增殖的主要因素。

與對照組(未給藥組)比較，*1P<0.05，*2P<0.01

圖1 MK2206對T24細胞的增殖影響

Compared with control group (without drug treatment)，*1P<0.05，*2P<0.01

Fig.1EffectofMK2206ontheproliferationofT24cells

2.2MK2206對T24細胞凋亡的影響 不同濃度(0，1，5，10 μmol·L-1)MK2206作用T24細胞24 h后，流式細胞術檢測細胞凋亡情況，結果見圖2，可見不同濃度的MK2206的細胞總凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡)與對照組(未給藥組)的(3.94±1.00)%比較，差異有統計學意義(P<0.01)。由圖2可知，隨著給藥濃度的增加，晚期凋亡細胞顯著增加(P<0.01)，其晚期凋亡率分別為(1.89±0.46)%，(4.77±0.84)%，(5.33±0.93)%和(30.97±1.32)%。

2.3MK2206對Akt因子的抑制作用 Western blotting法結果顯示，采用0～10 μmol·L-1的MK2206處理T24細胞24 h后，Akt因子所在的信號通路被抑制，Akt總蛋白表達無明顯差異，而給藥組的p-Akt(ser347)蛋白的表達與對照組比較，顯著降低(P<0.01)，見圖3。

2.4MK2206對T24細胞GSK-3β/β-catenin信號通路的影響 Western blotting法檢測不同濃度MK2206作用T24細胞24 h后，GSK-3β/β-catenin信號通路蛋白表達情況。結果見圖4。與對照組比較，GSK-3β總蛋白的表達無明顯差異(P>0.05)，而p-GSK-3β的表達顯著降低(P<0.05)。當MK2206濃度為1 μmol·L-1時，β-catenin的表達量(0.53±0.04)，與對照組(0.56±0.06)比較，差異無統計學意義(P>0.05)，而當濃度為5～10 μmol·L-1時，其表達量顯著低于對照組(P<0.01)。結果見圖4。

3 討論

膀胱癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一，多數為尿路上皮癌[6]。近年來對膀胱癌發病機制的研究不斷增多和深入。PI3K/Akt信號通路是目前研究較多的一條重要的細胞凋亡通路，該通路對腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡等進程具有重要的調控作用[7]。Akt因子是一種具有高度靈活的胞質蛋白[8]，在生長因子的刺激下，PI3K能夠使PIP2發生磷酸化并轉化為PIP3，而PIP3可以與Akt發生結合，進而募集Akt由胞質向胞膜轉移，從而使Thr308和Ser347位蛋白發生磷酸化，形成活化的Akt因子[9-10]，而活化的Akt因子又進一步促進糖原合成黑蛋白-GSK-3β發生磷酸化[11]，形成活化的GSK-3β并與之前結合的β-catenin發生解離，β-catenin呈游離狀態在胞質內不斷聚集凝結增多，部分由胞質轉移入核從而調控下游基因的轉錄翻譯過程，誘導一些炎癥反應的發生[12]。

MK2206是Akt因子的一種口服變構蛋白激酶抑制劑，其可以抑制Akt因子的3種亞型，即Akt1、Akt2和Akt3[13]。臨床研究發現在晚期實體腫瘤患者采用MK2206單一藥物治療過程中，患者具有較好的藥物耐受性[14]，細胞藥理實驗表明，MK2206對肺癌NCI-H460細胞和卵巢癌A2780系細胞具有不同程度的抑制增殖、促進凋亡的作用[15]。MATSUZAKI等[16]研究發現MK2206聯合氯奎寧對子宮內膜移位細胞的增殖和再生有抑制作用，且抑制效果優于單獨用藥。MK2206可以誘導細胞自噬，從而引起細胞凋亡[17]。WU等[18]研究發現，膀胱癌細胞的轉移和侵襲能力受PI3K/Akt信號調控的GSK-3β/β-catenin的活性的影響。本實驗研究表明，MK2206在濃度為1 μmol·L-1以上時，可有效抑制T24細胞Akt(Ser473)磷酸化，這為探索MK2206對T24細胞的Akt下游通路GSK-3β/β-catenin的影響奠定了基礎。

A.對照組(未給藥組)細胞的早期凋亡率和晚期凋亡率；B.當MK2206給藥濃度為1 μmol·L-1時，24 h時的早期凋亡率和晚期凋亡率；C.當給藥濃度為5 μmol·L-1時，T24細胞24 h后的早期凋亡率和晚期凋亡率；D.當給藥濃度為10 μmol·L-1時，24 h后T24細胞的早期凋亡率(右上)和晚期凋亡率(右下)。

圖2 MK2206對T24細胞凋亡影響

A.early apoptosis and late apoptosis for control group (without drug treatment);B.early apoptosis and late apoptosis of T24 cells treated by 1 μmol·L-1MK2206 for 24 h;C.early apoptosis and late apoptosis of T24 cells treated by 5 μmol·L-1MK2206 for 24 h;D.early apoptosis and late apoptosis of T24 cells treated by 10 μmol·L-1MK2206 for 24 h.Up right is early apoptosis and low right is late apoptosis

Fig.2EffectofMK2206ontheapoptosisofT24cells

A.Western blotting法檢測不同濃度MK2206對Akt/p-Akt蛋白表達影響條帶圖，GAPDH為內參蛋白；B.Akt/p-Akt蛋白表達水平的數據柱形圖。與對照組(未給藥組)比較，*1P<0.01

圖3 MK2206對T24細胞Akt/p-Akt蛋白表達影響

A.Effect of MK2206 at different concentration on Akt/p-Akt protein expression detected by Western blotting using GAPDH as internal reference；B.The data bar chart for the expression level of Akt/ p-Akt protein.Compared with control group (without drug treatment),*1P<0.01

Fig.3EffectofMK2206ontheproteinexpressionofAkt/p-AktinT24cells

本研究采用Western blotting法檢測了不同濃度MK2206 對T24細胞因子Akt下游通路蛋白GSK-3β/β-catenin的表達水平是否產生影響，結果表明MK2206通過抑制Akt因子磷酸化，進而降低GSK-3β的磷酸化和β-catenin蛋白表達水平，抑制了膀胱癌細胞增殖，促進凋亡。本研究為膀胱癌的藥物治療提供了一定的藥理研究基礎。

A.Western blotting法檢測不同濃度MK2206對GSK-3β/β-catenin蛋白表達影響條帶圖，GAPDH為內參蛋白；B.GSK-3β/β-catenin蛋白表達水平的數據柱形圖。與對照組(未給藥組)比較，*1P<0.05，*2P<0.01

圖4 MK2206對T24細胞GSK-3β/β-catenin信號通路的影響

A.Effect of MK2206 at different concentration on GSK-3β/β-catenin protein expression detected by Western blotting GAPDH as internal reference；B.The data bar chart for the expression level of GSK-3β/β-catenin protein expression detected protein.Compared with control group (without drug treatment),*1P<0.05，*2P<0.01

Fig.4EffectofMK2206onGSK-3β/β-cateninsignalpathwayinT24cells