綠茶多酚對缺血-再灌注氧化損傷腎臟的保護作用

曹智修，柳懿鵬，章傳華，袁敬東

(武漢市第一醫院泌尿外科，武漢 430022)

腎缺血-再灌注損傷在臨床工作中較為常見，尤其在腎部分切除術、腎移植術、腎血管成形術以及腎臟及周圍組織器官長時間氣腹操作等腔鏡手術中不可避免。腎缺血-再灌注損傷中氧化損傷是關鍵[1]。綠茶是東方人喜愛的飲品，具有較好的抗氧化作用和抗癌作用。筆者擬觀察綠茶中主要成分綠茶多酚對腎缺血-再灌注氧化損傷的影響，為開發新藥提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物 成年SPF級雄性SD大鼠30只，體質量(220±10) g，合格證號：20161108X-01，購自武漢生物制品研究所有限責任公司，動物生產許可證號：SCXK(鄂)2014-0012。將大鼠從1～30編號后用隨機數字表分為假手術組(Sham組)、缺血-再灌注組(I/R組)、綠茶多酚+缺血-再灌注組(I/R+G組)，每組各10只，分籠飼養于室溫25～27 ℃、相對濕度60%、自由飲食飲水的環境中。所有動物飼養及手術操作均在武漢市第一醫院動物實驗中心進行，動物處理獲得華中科技大學動物倫理委員會批準，遵循華中科技大學實驗動物管理規定執行。

1.2灌藥及手術處理 將綠茶多酚(陜西森佛天然制品有限公司，含量：99%，批號：WS20140231)1 g溶入0.9%氯化鈉溶液100 mL中，配制成10 mg·mL-1灌胃液，I/R組和I/R+G組大鼠分別給予0.9%氯化鈉溶液和綠茶多酚每天灌胃1次，根據大鼠體質量按照60 mg·kg-1的劑量灌胃，持續4周。持續綠茶多酚灌胃結束后，所有大鼠以戊巴比妥鈉(上海中西藥業股份有限公司，批號：WS20130113)腹腔注射麻醉，暴露左側腎蒂，I/R組和I/R+G組參照ARAVINDAN等[2]介紹的方法，動脈夾阻斷左腎動靜脈50 min，左腎動靜脈血流恢復后60 min切取左側腎臟，Sham組麻醉后，暴露左側腎蒂110 min后切取左側腎臟，動物處死后所獲得腎臟分為兩部分行指標檢測。

1.3超氧化物趨化酶(SOD)和丙二醛(MDA)檢測 所獲取的組織用0.9%氯化鈉溶液將表面血跡清洗干凈后，加入組織裂解液，離心后收集上清液，一部分通過二喹啉甲酸(BCA)法對上清液行蛋白濃度檢測，另一部分通過羥胺法測定SOD吸光度值，通過TAB法測定MDA吸光度值。并結合蛋白濃度計算SOD活力和MDA含量。蛋白測定試劑盒(批號：20151105)購自碧云天生物技術研究所，SOD(批號：20161203)和MDA(批號：20161124)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.4腎損傷分子-1(KIM-1)表達檢測 所獲取腎組織浸泡于10%多聚甲醛后，石蠟包埋固定，切片機切成厚度5 μm薄片于載玻片上，經脫蠟、脫水、抗原修復后，加兔抗鼠KIM-1(美國CST公司，批號：2017003206001)一抗于4 ℃過夜，沖洗干凈后加入羊抗兔二抗(碧云天生物技術研究所，批號：20151140)并行著色、脫水、封片，于Olympus 70顯微鏡下觀察。隨機選取5個視野進行觀察并按照CAO等[3]介紹的方法計算每個視野的KIM-1表達評分。

1.5組織細胞凋亡情況檢測 切片的組織經脫蠟、脫水后按凋亡試劑盒(瑞士羅氏試劑公司，批號：2017098760045)步驟通過TUNEL法進行凋亡細胞標記，隨后進行著色、脫水、封片，于Olympus 70顯微鏡下觀察。隨機選取5個高倍視野進行觀察，并計算每個視野的凋亡指數(AI)=凋亡細胞總數/觀察總細胞數。

2 結果

2.1SOD和MDA含量 Sham組SOD活性為(510.67±16.91) U·mg-1，經缺血-再灌注處理后I/R組、I/R+G組SOD分別為(174.02±9.62)，(439.17±8.27) U·mg-1。Sham組和I/R+G組SOD明顯較I/R組高(P<0.05)。Sham組MDA含量為(0.02±0.03) nmol·mg-1，經缺血-再灌注處理后I/R組、I/R+G組MDA含量分別為(4.10±0.09)，(1.78±0.08) nmol·mg-1。Sham組和I/R+G組MDA明顯較I/R組低(P<0.05)(圖1)。

2.2KIM-1 表達 I/R組KIM-1表達明顯比Sham組和I/R+G組增強(圖2)，Sham組KIM-1表達評分為0.02±0.02，I/R組、I/R+G組KIM-1表達評分分別為4.52±0.11，1.98±0.09，Sham組和I/R+G組KIM-1表達評分值明顯較I/R組低(P<0.05)。

2.3腎小管細胞凋亡情況 I/R組凋亡的腎小管細胞明顯較Sham組和I/R+G組多，Sham組腎小管細胞凋亡指數為0.08±0.08，I/R組、I/R+G組腎小管細胞凋亡指數分別為53.39±2.95，14.86±1.19，Sham組和I/R+G組腎小管細胞凋亡指數明顯較I/R組低(P<0.05)( 圖3)。

3 討論

氧化應激所產生的過多活性氧基團是造成缺血-再灌注過程中組織細胞損傷的關鍵因素[4-5]，脂質過氧化物是腎臟缺血-再灌注氧化應激過程中產生的有害物質，能夠損傷細胞脂質層的結構和功能[6-7]。實驗研究證實，抗氧化劑治療能在一定程度上預防缺血-再灌注過程中產生的脂質過氧化物造成的損傷[8-9]。 綠茶多酚是從綠茶中提取的活性成分，具有很強的清除活性氧能力和抗氧化活性[10]，能夠緩解慢性疾病引起的氧化損傷，減少機體氧化應激反應，從而起到改善機體因功能缺陷造成的損傷[11-13]。本研究結果顯示，綠茶多酚對大鼠缺血-再灌注氧化損傷腎臟具有保護作用。

SOD是氧化應激過程中能夠特異性清除氧自由基的抗氧化酶，其活性高低通常能反映機體抗氧化能力的強弱[14]。MDA是機體遭受氧化損傷后產生的脂質過氧化物降解物。機體產生MDA后可導致組織細胞膜流動性降低，生物活性功能降低，同時MDA為細胞毒性物質，本身會造成細胞損傷[15]。本研究發現經綠茶多酚干預處理后的大鼠SOD活力明顯較未干預組高，而MDA產生量低于未干預組，說明綠茶多酚能夠有效增強腎臟組織抗氧化能力。

與I/R組比較，*1P<0.05

Compared with the I/R group，*1P<0.05

Fig.1SODandMDAcontentsinthreegroupsofrats(n=10)

KIM-1是腎臟損傷后表達于腎小管的跨膜蛋白，通常正常腎臟組織不表達，但當腎臟缺血或毒性損傷后高表達，它是檢測腎臟損傷的敏感指標[16]。本研究發現，Sham組無KIM-1表達，經綠茶多酚干預的缺血-再灌注組和未經綠茶多酚的缺血-再灌注組KIM-1均有不同程度表達，但未經綠茶多酚干預組的KIM-1表達明顯增強，說明綠茶多酚在防止腎臟缺血-再灌注氧化損傷的基礎上，進一步降低了腎組織細胞的損傷。TUNEL法檢測凋亡細胞也證實，經綠茶多酚干預后缺血-再灌注腎臟腎小管細胞凋亡指數明顯較未干預的缺血-再灌注腎臟低，說明綠茶多酚有較好的降低腎臟缺血-再灌注損傷的功能

與I/R組比較，*1P<0.05

與I/R組比較，*1P<0.05