腦膠質瘤中心體的異常擴增及其與疾病分期的相關性

陸玉成，王麗娟，車峰遠，于繼徐，姜良軍，張禮忠，李少欽

1.山西大學 生命科學學院，山西 太原 030000；2.臨沂市人民院 中心實驗室，山東 臨沂 276000；3.臨沂市人民醫院 神經內科，山東 臨沂 276000；4.臨沂市人民醫院 病理科，山東 臨沂276000；5.江蘇師范大學 生命科學學院，江蘇 徐州 221000

中心體是由2 個中心粒及其周圍物質組成的非膜細胞器，存在于哺乳動物和低等植物細胞中。它是細胞的微管組織中心，對于細胞分裂和維持基因組穩定性非常重要[1]。在正常細胞中，中心體負責產生兩極有絲分裂紡錘體，促進染色體分離成2 個相同的子細胞，在每個子細胞中均包含1 個中心體。中心體異常擴增，是在一個細胞中出現超過2 個中心體的情況。現已發現中心體異常擴增存在于各種類型的癌癥中，包括各種實體腫瘤和白血病[2]。

膠質瘤是人腦中樞神經系統中最常見的惡性腫瘤之一，由于其與腦組織邊界不清晰，且常常呈浸潤性生長，所以手術不易將其完全切除，并且術后常出現高復發率和高致殘率。雖然現在對膠質瘤采用手術切除和術后放、化療等綜合治療，但總體治療效果不好[3]。先前研究報道[4]，中心體擴增與多種腫瘤的發生發展相關，但目前還沒有關于膠質瘤方面的報道。

我們收集正常腦組織和各級別腦膠質瘤共50 例，用HE 染色和免疫組化檢測Ki67 陽性表達來確定腦膠質瘤的分級，并采用免疫組化和免疫熒光方法檢測中心體擴增與膠質瘤分期的相關性，旨在探討中心體擴增在膠質瘤中的表達及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 組織標本

收集臨沂市人民醫院2017年1～12月的腦膠質瘤組織標本40 例（實驗組），收集重癥腦外傷手術患者的正常腦組織標本10 例（對照組），依據2016年世界衛生組織的中樞神經系統腫瘤分類標準，包括Ⅰ/Ⅱ級 20 例、Ⅲ級 10 例、Ⅳ級 10 例。本研究通過了臨沂市人民醫院倫理委員會批準，并且所選患者均簽署知情同意書。

1.2 材料

光學顯微鏡購自Olympus 公司；γ-微管蛋白抗體和Ki-67 抗體購自Cell Signaling Technology公司；光譜型SP 試劑盒、DAB 顯色劑購自福州邁新生物技術有限公司。

1.3 蘇木精-伊紅（HE）染色

取材置于4%多聚甲醛溶液中，過夜固定；次日進行乙醇由低到高梯度脫水和二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋；包埋后切片，置于載玻片上，再用二甲苯進行脫蠟處理，接著再進行乙醇由高到低梯度至水洗，再行蘇木精染色，水洗1～2 min，鹽酸乙醇分化，水洗1～2 min，0.5%氨水水洗反藍，水洗1～2 min，伊紅染色，90%乙醇1 min，無水乙醇2 次，每次2 min，封片保存，并在光學顯微鏡下觀察腦組織的病理變化。

1.4 免疫組化

組織標本經4%甲醛溶液固定，常規石蠟包埋，5 μm 連續切片，二甲苯脫蠟，經枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）抗原修復處理，3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶，用10%小牛血清封閉，然后加入γ-微管蛋白和Ki67 抗體，PBS 沖洗，加入二抗及SP/HRP，DAB 顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片。

1.5 免疫熒光

連續切片2 μm，將切片貼附于經多聚賴氨酸處理的載玻片上，60℃烤片30 min，二甲苯脫蠟，乙醇復水，經枸櫞酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH6.0）抗原修復處理，滴加小牛血清封閉處理，滴加γ-微管蛋白抗體，用于顯示中心體，于4℃冰箱中過夜，滴加二抗（室溫下避光濕盒孵育1 h），加入DAPI 進行細胞核染色，用抗熒光淬滅劑封片。從制備的標本中隨機抽取2～4 張切片，以一抗不加γ-微管蛋白的同步染色作為陰性對照。

1.6 結果判定

1.6.1 免疫組化結果評價 隨機抽取制備的切片，在雙盲情況下由2 名病理科同事觀察評價結果并采集病理圖像。γ-微管蛋白染色陽性定位為細胞質內呈均勻著色的棕黃色，其中細胞核處會著色深；Ki67 染色陽性定位為細胞核著色為棕黃色。計數陽性細胞百分率和陽性細胞數。

1.6.2 中心體觀察與計數 具有以下特征之一可判定為中心體異常擴增：①在一個細胞中觀察到3 個或3 個以上中心體；②中心體直徑大于同一張切片中心體直徑的2 倍或以上；③形狀異常中心體，包括長形中心體、線狀中心體、成塊狀中心體及成簇堆積中心體。

在熒光顯微鏡10×100 倍數下，每張切片選取腫瘤區10 個視野，首先計數視野內腫瘤細胞數，接著計數具有異常中心體的細胞數，計算每個樣本異常中心體細胞占所計數的腫瘤細胞數的百分率，即中心體異常擴增率。

1.7 統計學分析

采用SPSS 21.0 統計學軟件分析，計量材料采用x±s，2組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色檢測組織標本的病理變化

正常腦組織層次分明，細胞密度均勻，細胞核規則，無異型性細胞；Ⅰ/Ⅱ級膠質瘤細胞密度增加，異型性較明顯，核深染但較規則，可出現少數多核或瘤巨細胞；Ⅲ級細胞大小形態不一致，細胞排列紊亂，核異型性更加明顯；Ⅳ級細胞大小形態極不一致，出現多核瘤巨細胞，核膜不清晰，可多至數個核，出現大面積壞死灶（圖1）。

2.2 Ki67在膠質瘤中的表達及其相關性

Ki67 在正常腦組織中沒有陽性表達；在Ⅰ/Ⅱ級膠質瘤中，13 例陽性表達，7 例陰性表達，陽性表達率為65%；Ⅲ級中8 例陽性表達，2 例陰性表達，陽性表達率為80%；Ⅳ級中10 例全部陽性表達，陽性表達率為100%（圖2）。分析表明Ki67 在不同腦組織中的表達強度具有統計學差異（χ2=24.753，P＜0.01）（表1）。與正常腦組織相比，Ⅰ/Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ級膠質瘤組織的Ki67 陽性表達率均較高，差異具有統計學意義（均P＜0.001）。

2.3 免疫組化檢測γ-微管蛋白的表達

γ-微管蛋白是微管蛋白家族成員，具有控制有絲分裂紡錘體復制的功能，是中心體復制的重要蛋白[5]。當前在中心體的研究中，都是通過檢測γ-微管蛋白來評估中心體的表達情況。免疫組化結果顯示，在正常組織中，僅有3 例細胞質中出現淺黃色，其余均為陰性表達；Ⅰ/Ⅱ級膠質瘤中，有10 例出現細胞質黃色，并且有的細胞核附近出現陽性表達；Ⅲ級中有8 例出現陽性表達，并且細胞核及其周圍出現棕黃色；Ⅳ級中全部10 例出現細胞核與周圍胞質棕褐色表達，并且表達情況明顯強于其他級別與正常腦組織（圖3）。對γ-微管蛋白表達情況做了統計學分析，具有統計學意義（表2）。

圖1 正常腦組織和膠質瘤組織HE染色結果（×200）

圖2 正常腦組織和膠質瘤組織中Ki67的表達（×200）

表1 Ki67在正常腦組織和各膠質瘤級別中的表達

2.4 免疫熒光檢測中心體的表達

結果見圖4。細胞核呈藍色，γ-微管蛋白在細胞中呈紅色，顯示此處為中心體。中心體異常擴增表現在中心體數目增加（多于2 個）、中心體體積增大、中心體形狀異常。正常對照組中未發現中心體異常，Ⅰ/Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級膠質瘤中分別有2.25%±1.15%、5.04%±2.12%和5.25%±2.23%的中心體異常擴增。

3 討論

膠質瘤是原發性的顱內神經惡性腫瘤。2016年，世界衛生組織將其分為4 個級別，其中Ⅰ/Ⅱ級為低級別膠質瘤，Ⅲ/Ⅳ級為高級別膠質瘤。級別越低越容易治療，且預后相對較好，生存時間相對較長，而高級別膠質瘤難治療，預后較差，生存時間也相對較短。當前膠質瘤的診斷主要依據患者的臨床表現（如頭痛頭暈、惡心嘔吐和視覺障礙等），再加以輔助檢查（如顱腦CT 平掃、顱腦核磁共振平掃和PET 等）。對膠質瘤級別的判斷還須進行病理學分析。我們的結果顯示，與正常腦細胞相比，Ⅰ/Ⅱ級膠質瘤細胞密度增加，異型性較明顯，胞核深染但較規則，出現少數多核或瘤巨細胞；Ⅲ級細胞大小形態不一致，細胞排列紊亂，核異型性更加明顯；Ⅳ級細胞大小形態極不一致，出現多核瘤巨細胞，核膜不清晰，可多至數個核，出現大面積壞死灶。

圖3 正常腦組織和膠質瘤組織中γ-微管蛋白的表達（×1000）

表2 γ-微管蛋白在正常腦組織和各膠質瘤級別中的表達

Ki67 是一種細胞核抗原，它的表達情況常常與腫瘤的形成、浸潤和轉移等惡性程度相關，所以Ki67 通常作為腫瘤細胞增殖狀態的一個重要指標。最近有文獻[6]報道，Ki67 在許多惡性腫瘤中表達程度的升高造成了差的臨床療效及預后。我們的實驗表明，正常腦組織中沒有發現Ki67的表達，Ⅰ/Ⅱ級膠質瘤中Ki67 陽性表達率為65%，Ⅲ級膠質瘤中Ki67 陽性表達率為80%，Ⅳ級膠質瘤中Ki67 陽性表達率為100%。從以上結果可以觀察到，Ki67 陽性表達率與膠質瘤級別的升高呈正相關。Smith 等[7]也發現正常腦組織中Ki67沒有陽性表達；Wanyne[8]和 Okumura 等[9]也報道了Ki67 在不同病理級別的腦膠質瘤中均陽性表達，并且隨著腫瘤級別升高，表達率和表達強度均升高。這和本研究結果相一致。

圖4 免疫熒光檢測中心體擴增（×1000）

中心體是動物細胞中主要的微管組織中心，參與維持細胞極性、染色體的正確分離。γ-微管蛋白作為中心體微管蛋白家族成員之一，控制著有絲分裂紡錘體的復制[5]，是有絲分裂中心體復制中的關鍵蛋白，實驗中通常以檢測γ-微管蛋白的表達來反映中心體狀態。中心體擴增是指1 個細胞中包含2 個以上的中心體。眾所周知，中心體擴增可以引起染色體不穩定，從而引起基因組的不穩定，造成腫瘤發生，可以增加腫瘤的侵襲性并使患者的預后變差[10-11]。鑒于此，中心體擴增在臨床檢測中的應用越來越多。Pihan 等[12]報道，在子宮頸癌、膀胱癌和乳腺癌中，中心體擴增均發生在癌癥早期階段。Mahathre 等[13]報道，在結直腸癌中，中心體擴增可以作為一個生物標志物，并可作為個性化治療的靶點。Yamamoto 等[14]報道，中心體擴增可以作為尿路上皮癌分類與預后評估的生物標志物。我們的結果顯示，在正常腦組織中未發生中心體擴增，但在不同級別的膠質瘤樣本中都檢測到了中心體擴增，并且從低級別到高級別的進展中，中心體在細胞中的擴增率是逐漸升高的，表明在膠質瘤中中心體擴增也可以作為腫瘤發展和臨床病理分級的標志物。

總之，中心體異常擴增隨著膠質瘤的級別升高呈逐漸遞增趨勢，說明中心體擴增是膠質瘤發展過程中不可缺少的重要環節。當然，我們的發現還須大量樣本進一步檢驗。相信未來對中心體擴增的研究將有利于改善膠質瘤患者的預后。