鎘對胎盤絨毛外滋養層HTR-8/SVneo細胞內抗氧化酶活性的影響

李向陽，田青，董峰

山西大學 生命科學學院，山西 太原 030006

隨著工業化的發展，重金屬污染問題日益突出，已經嚴重威脅到動物和人類的健康。其中，重金屬鎘（cadmium，Cd）伴隨著采礦、冶金和電池制造等行業產生的廢水、廢氣和廢渣釋放到環境中[1]，并通過生物富集和食物鏈進入動物和人類機體，造成胎盤、睪丸、腎、肝、肺、大腦和心臟等多個組織和器官損傷[2-5]。更重要的是，Cd 在動物和人類機體內不易排出，半衰期長達10～30年，具有潛在的致癌、致畸、致突變作用[6]。

胎盤是哺乳動物妊娠過程中的臨時性器官，其主要作用是為胎兒傳遞營養物質、運輸代謝產物和分泌激素[7-9]。胎盤的正常發育主要取決于滋養層細胞增殖和分化的正常進行[10]。胎盤的功能受損可能會引起先兆子癇、胎兒發育遲緩甚至流產[11-12]。研究發現胎盤對重金屬Cd 具有一定的屏障作用，蓄積在母體胎盤中的Cd，只有極小的部分會穿過胎盤直接作用于胎兒[13]。Cd 可以引起小鼠滋養層細胞腫脹變形和空泡化，抑制細胞的增殖并增加其凋亡率，造成胎盤萎縮[14]。Cd 可以誘導胎盤JEG-3 細胞產生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），引起胎盤內氧化與抗氧化失衡，阻礙胎盤的正常發育[15]。這提示我們，Cd可能通過增加胎盤內ROS，降低胎盤內抗氧化酶活性，進而影響胎盤的正常功能。因此，我們以HTR-8/SVneo 細胞為研究對象，檢測Cd 對HTR-8/SVneo 細胞活性、形態、ROS 水平、抗氧化酶活性和丙二醛（malonyldialdehyde，MDA）含量的影響，為研究Cd的胎盤毒性提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

胎盤絨毛外滋養層HTR-8/SVneo 細胞購于ATCC，用含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素、鏈霉素）的RPMI1640 培養基，在37℃、5% CO2培養箱內培養。

RPMI1640 培養基購于Gibco 公司；胎牛血清購于杭州四季青公司；氯化鎘（CdCl2）購于Sigma公司；CCK-8 試劑盒購于博士德公司；ROS 檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、過氧化氫酶（CAT）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）試劑盒和MDA試劑盒購自南京建成生物工程研究所；其他各類試劑均為分析純試劑。

1.2 CCK-8檢測細胞活性

收集對數生長期細胞，96 孔板內每孔接種1.0×104細胞，設置對照組和CdCl2處理組，每組設3 個重復孔。待細胞密度達60%左右時，加入不同濃度（0、3、6、12 μmol/L）CdCl2處理細胞24 h，或者用12 μmol/L CdCl2處理不同時間（0、6、12、24 h）；處理結束后，每孔加入 10 μL CCK-8 溶液，培養箱中避光孵育1 h，酶標儀檢測D450nm值，計算細胞存活率。

1.3 顯微鏡觀察細胞形態變化

收集對數生長期細胞，96 孔板內每孔接種1.0×104細胞，設置對照組和 CdCl2處理組、CdCl2與N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）共處理組，每組3 個重復孔。待細胞密度達60%左右時，用12 μmol/L CdCl2處理不同時間（0、6、12、24 h）；CdCl2與NAC 共處理組先用500 μmol/L NAC 預處理細胞2 h，然后加入 12 μmol/L CdCl2與 500 μmol/L NAC 共同處理細胞24 h。處理結束后，PBS 清洗細胞1 次，光學顯微鏡下觀察細胞形態并拍照。

1.4 ROS含量檢測

收集對數生長期細胞，6 孔板內每孔接種3.0×105細胞，設置對照組和 CdCl2處理組、CdCl2與NAC 共處理組，待細胞密度達到60%左右時，用12 μmol/L CdCl2處理不同時間（0、6、12、24 h）；CdCl2與 NAC 共處理組先用 500 μmol/L NAC 預處理細胞 2 h，然后加入 12 μmol/L CdCl2與 500 μmol/L NAC 共同處理細胞24 h。處理結束后，PBS 清洗細胞 1 次，各孔加入 1 mL DCFH-DA 探針溶液（用無血清 RPMI1640 培養基 1∶1000 稀釋），避光孵育30 min，收集細胞，用流式儀檢測細胞內ROS 含量變化。

1.5 SOD、CAT、GPx活性及MDA含量檢測

收集對數生長期細胞，每個10 cm 培養皿內接種2.0×106細胞，設置對照組和CdCl2處理組、CdCl2與NAC 共處理組。待細胞密度達60%左右時，用 12 μmol/L CdCl2處理不同時間（0、6、12、24 h）；CdCl2與 NAC 共處理組先用 500 μmol/L NAC 預處理細胞2 h，然后加入12 μmol/L CdCl2與500 μmol/L NAC 共同處理細胞24 h。處理結束后收集細胞，于冰上勻漿破碎細胞，12 000 r/min 離心10 min，上清液即為細胞總蛋白。BCA法測定蛋白濃度，按照試劑盒說明檢測細胞內SOD、CAT、GPx 活性和MDA 含量變化。

1.6 數據分析

所有實驗數據使用SPSS 17.0 軟件進行單因素方差（One-Way ANOVA）分析，實驗結果以mean±SEM 表示，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結果

2.1 CdCl2抑制HTR-8/SVneo細胞活性

如圖1所示，HTR-8/SVneo 細胞經 0、3、6、12 μmol/L CdCl2處理 24 h，或經 12 μmol/L CdCl2分別處理 0、6、12、24 h 后，細胞活性隨CdCl2濃度的增大或處理時間的延長而逐漸降低（P＜0.01），呈濃度和時間依賴性。

2.2 CdCl2引起HTR-8/SVneo細胞形態損傷

CCK-8 結果顯示 CdCl2引起 HTR-8/Svneo 活性下降，本研究后續實驗采用時間依賴模型探究CdCl2引起細胞毒性損傷的機制。如圖2所示，對照組細胞呈典型的鋪路石狀；隨著CdCl2處理時間的延長，細胞數量逐漸減少，細胞之間的間隙逐漸增大，并發生皺縮、變圓，有的細胞甚至脫落。經500 μmol/L NAC 與12 μmol/L CdCl2共同處理24 h 后，細胞皺縮、變圓現象減少，說明NAC 明顯緩解了Cd 引起的HTR-8/SVneo 細胞形態損傷。

2.3 CdCl2激發HTR-8/SVneo細胞內ROS升高

圖1 CdCl2對HTR-8/SVneo細胞活性的影響

圖2 CdCl2對HTR-8/SVneo細胞形態的影響

12 μmol/L CdCl2分別處理HTR-8/SVneo 細胞0、6、12、24 h 后，用 DCFH-DA 標記細胞，通過流式細胞儀檢測細胞內ROS 含量，結果見圖3。隨著處理時間的延長，細胞內ROS 含量逐漸升高。與對照組相比，12 μmol/L CdCl2處理 HTR-8/SV?neo 細胞 12 h 時，ROS 含量顯著升高，約為對照組的 2.30 倍（P＜0.05）；處理時間達24 h 時，升高至對照的 2.97 倍。用 500 μmol/L NAC 與 12 μmol/L CdCl2共處理，發現 NAC 可 以有效抑制 CdCl2引起的HTR-8/SVneo 細胞內ROS 含量升高。

2.4 CdCl2造成HTR-8/SVneo細胞內抗氧化酶的活性降低

與對照組相比，經12 μmol/L CdCl2處理后，HTR-8/SVneo 細胞內 CAT、GPx 和 SOD 活性呈時間依賴性降低，在處理12 h 時CAT 活性開始出現顯著性降低（圖4A，P＜0.05），處理 24 h 時 SOD 和GPx 活性顯著降低（圖4B、C，P＜0.05，P＜0.01）。用500 μmol/L NAC 與 12 μmol/L CdCl2共處理，發現NAC 可以有效緩解CdCl2引起的HTR-8/SVneo細胞內抗氧化酶活性的降低。

2.5 CdCl2引起HTR-8/SVneo細胞脂質過氧化

如圖4D所示，經 12 μmol/L CdCl2處理后，細胞內的MDA 含量逐漸增加，處理12 h 時MDA 含量顯著性升高（P＜0.05），處理 24 h 時 MDA 含量與對照組相比差異極顯著（P＜0.01），升高至對照組的 3.11 倍，說明 CdCl2引起了 HTR-8/SVneo 細胞脂質過氧化損傷。用500 μmol/L NAC 與12 μmol/L CdCl2共處理，NAC 可以有效抑制 CdCl2引起的HTR-8/SVneo 細胞脂質過氧化。

3 討論

環境中的Cd 可通過多種途徑如攝食、飲水和呼吸進入人體，對多個器官和組織造成損傷[2-5]。在妊娠期時，Cd 更易在胎盤中蓄積，并隨著妊娠期的延長而蓄積量明顯增加[16]。Cd 在胎盤中的蓄積，使得胎盤極易發生毒性損傷，已有研究表明Cd 能引起胎盤功能受損，并導致先兆子癇、胎兒發育遲緩甚至流產[14]。

圖3 CdCl2對HTR-8/SVneo細胞內ROS含量的影響

圖4 CdCl2對HTR-8/SVneo細胞內CAT（A）、GPx（B）、SOD（C）和MDA（D）的影響（*P＜0.05，#P＜0.05，**P＜0.01，##P＜0.01）

許多研究表明Cd 可以引起胎盤、腎臟、肝臟和大腦等多個器官和組織ROS 水平升高，引發氧化損傷[14,17-18]。汪紀倉等證實醋酸鎘（CdAc2）能誘導大鼠肝臟細胞ROS 水平升高和形態變化，并且經抗氧化劑NAC 處理后，細胞的皺縮變圓現象明顯減少[19]。本研究發現CdCl2能夠造成絨毛外滋養層HTR-8/SVneo 細胞活性下降和形態學損傷，激發 HTR-8/SVneo 細胞內 ROS 生成；并且，ROS 清除劑NAC 與CdCl2共處理，顯著抑制了CdCl2引起的HTR-8/SVneo 細胞形態損傷和活性下降。以上結果說明Cd 引起的HTR-8/SVneo 細胞活性下降和形態變化與Cd 激發的細胞內ROS 升高有關。

當細胞發生ROS 升高時會啟動自身的抗氧化系統，包括多種抗氧化酶如SOD、CAT、GPx[20]，以及谷胱甘肽（GSH）、褪黑素、維生素C、維生素E[21-24]等。SOD 可以清除細胞內過多的超氧陰離子自由基，CAT 可以清除細胞內的H2O2[20]。GPx 可以催化細胞內天然抗氧化物GSH 轉化為氧化型谷胱甘肽（GSSG），從而達到清除多種自由基的作用[25]。體外實驗發現Cd 可以引起A549 細胞內ROS 含量升高，并造成脂質過氧化損傷，最終耗竭細胞內的 SOD 和 GPx[26]；Cd 也可以降低 HepG2細胞內CAT的活性[27]。本研究發現隨著CdCl2處理時間的延長，SOD、CAT、GPx的活性逐漸降低，可能是細胞內抗氧化酶在發揮清除ROS 作用時逐漸被消耗。CdCl2處理HTR-8/SVneo 細胞，引起CAT 活性在12 h 時開始出現顯著性降低，而SOD和GPx 活性則在24 h 時出現顯著性差異，其原因可能是在HTR-8/SVneo 細胞內，各種抗氧化酶的含量及其開始發揮清除自由基作用的時間上存在差異。MDA 是細胞受到脂質過氧化損傷時的標志分子[28]。在本研究中CdCl2處理12 h 時，HTR-8/SVneo 細胞內MDA 含量開始出現顯著性升高，說明Cd 能夠導致HTR-8/SVneo 細胞發生脂質過氧化。

以上結果證實Cd 引起HTR-8/SVneo 細胞內ROS 含量增加，消耗細胞內的 SOD、CAT、GPx 等抗氧化酶，并引發脂質過氧化損傷，NAC 則可以有效緩解Cd 引起的細胞內ROS 升高與抗氧化酶活性降低。本研究為闡明Cd的胎盤毒性機制提供了基礎，為篩選治療Cd 致胎盤毒性損傷的藥物提供了思路。