嬰兒糞便中益生菌的分離篩選及培養

鄭麗君，吳秀英，李洪亮，孫 濤

（內蒙古蒙牛乳業（集團）股份有限公司，內蒙古呼和浩特 011517）

0 引言

益生菌是一類可以對宿主細胞起到有益作用的活性微生物，定植在人體腸道和生殖系統中[1]，分為乳酸菌類、雙歧桿菌類、革蘭氏陽性雙歧桿菌。研究顯示，人體中微生物種類約30個種屬，大多集中在大腸中。人體健康與胃腸道微生物種群的種類與數量，尤其是生長于大腸內的微生物種群有直接關系[2]。

剛出生的嬰兒消化系統近似無菌，僅有少量腸桿菌定植。經母乳喂養后就會有大量微生物開始定植，在2 d內糞便里就能檢測到腸桿菌、金色葡萄菌等[1]，再過3～4 d，雙歧桿菌也開始定植于腸道。有研究顯示正常母乳喂養的健康嬰兒在1月齡時，雙歧桿菌為優勢菌，同時還有大量的大腸桿菌和乳酸桿菌。隨著生長，雙歧桿菌數量略有增加，仍為優勢菌[3]。此時，乳酸桿菌數量逐漸增加，大腸桿菌在6月齡時明顯下降，以后相對平穩，總體變化是從需氧菌和兼性厭氧菌占優勢轉變到厭氧菌占優勢。益生菌種類中雙歧桿菌、乳酸桿菌一直都是健康嬰兒腸道內的優勢菌群。

雙歧桿菌和乳酸桿菌的益生作用廣受關注，雙歧桿菌能否耐受胃酸、腸液和膽汁是影響其益生功能的關鍵因素，由于來自人體的雙歧桿菌較易在人體腸道中定植，所以研究旨在從嬰兒糞便中進行分離、培養雙歧桿菌和乳酸桿菌并鑒定其生長特性，再從中篩選出具有潛在益生特性的純菌株，為益生菌產業應用于發酵食品提供更多的菌種資源和參考依據。

1 益生菌種的培養與篩選

1.1 樣本

河南省洛陽市母乳喂養嬰兒糞便（2個月內），采樣期嬰兒均無腸胃不適癥狀，采樣前2周內未服用過任何藥物。

1.2 分離培養試驗方法

1.2.1 乳酸桿菌分離純化

將嬰兒新鮮糞便挑取5～10 g，裝入甘油管并轉移至放有生物冰袋的冷藏箱中待用。在無菌操作臺將已厭氧保存的嬰兒糞便樣1 g，轉移至裝有9 mL的無菌生理鹽水中并至均勻，依次進行10倍的梯度稀釋到 1×10-8，用移液槍吸取 1×10-6，1×10-7，1×10-83個梯度的稀釋液各100 μL于固體培養基MRS-CaCO3中，每個稀釋度平行3個平板[4]。放入真空培養皿中抽真空，然后充入CO2，反復2次，模擬厭氧環境，此外每一個梯度用1個平板在空氣中培養做對照。然后在恒溫生化培養箱中倒置平板，于37℃恒溫下培養48 h后，挑取表面具備乳酸桿菌特性的菌落，接種到MRS液體培養基中進行擴大培養；重復上述步驟，然后進行革蘭氏染色試驗鏡檢，確定為革蘭氏陽性菌株為純菌株后，再活化一代，并進行過氧化氫酶試驗。利用這樣的方法培養2次，得到在液體培養基中為較純的乳酸菌菌種。把最后得到的乳酸菌菌種在MRS液體培養基中放入4℃冰箱保存待用[5]。

根據乳酸桿菌基本特征，在液體培養基中找到符合上述特點的5個純菌株暫時定為乳酸桿菌[6]。

1.2.2 5株乳酸桿菌基本信息

5株乳酸桿菌菌株鏡檢、菌落特征、菌落形態見表1。

1.2.3 雙歧桿菌的分離純化

表1 5株乳酸桿菌菌株鏡檢、菌落特征、菌落形態

樣品處理過程同乳酸桿菌，培養基改良MRS培養基。

根據雙歧桿菌特征從液體培養基中得到5株符合上述特點的菌株，暫定為雙歧桿菌[7]。

1.2.4 5株雙歧桿菌基本信息

5株雙歧桿菌菌株初步檢測基本信息見表2。

表2 5株雙歧桿菌菌株初步檢測基本信息

2 乳酸桿菌菌株和雙歧桿菌菌株鑒定

2.1 5株乳酸桿菌的益生鑒定

根據細菌屬水平和種水平的分類鑒定程序，選擇鏡檢中無分叉的G+桿菌，將其傳代純化培養，在pH值4.5的酸度下可適應酸度生長，過氧化氫酶試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗、硫化氫試驗均為陰性，即鑒定其為乳酸桿菌屬，由于乳酸桿菌鑒定結果一樣，所以可近似一致。除了屬水平試驗鑒定，還需有種水平的鑒定才是完整的鑒定過程[8]。

2.1.1 基礎試驗鑒定（5株乳酸桿菌同步進行）

吲哚鑒定試驗中，乙醚和培養物相互作用后未出現紅色環狀物，可初步確定是陰性，符合基本特征；需氧鑒定試驗中，將接種管與空氣中接觸培養后，培養液有少許渾濁現象，且管底有部分菌體沉淀，可判斷菌株為兼性厭氧；明膠鑒定液化試驗，將已接種的接種管和未接種的對照試管一起放于冰箱中，待對照管凝固時，對照接種管也同時凝固，可判斷為陰性反應，符合基本特征。

2.1.2 耐膽鹽鑒定試驗

將經過活化的菌株按培養基2%的接種量接種在膽鹽質量濃度依次是0，0.3，0.6 g/L的MRS液體培養基中，于37℃恒溫生化培養箱中培養24 h，依次測各組菌株菌液的OD600nm值。

5株純乳酸桿菌菌株在不同膽鹽質量濃度含量時培養基中培養24 h的OD600nm值見表3。

表3 5株純乳酸桿菌菌株在不同膽鹽質量濃度含量時培養基中培養24 h的OD600 nm值

經過試驗可知，在膽鹽質量濃度為0.3，0.6 g/L時，對5株乳酸桿菌生長都有明顯的抑制作用，但經過2種培養基恒溫培養24 h后，5株菌均能繼續生長繁殖，僅RS1生長稍差，由此可知這5株菌均具有一定的耐膽鹽能力，基本符合文獻和綜述。

2.1.3 溫度敏感鑒定試驗

菌株經過活化培養后，以培養基2%的接種量接種在5個含有MRS液體培養基的試管中。分別設置溫度為45，50，55，60℃，處理30 min，其中1管不進行相關溫度處理，只作為空白對照組[9]，其余試管在37℃恒溫培養生化箱中培養16 h，測各試管中菌液的OD600nm值。

5株乳酸桿菌在不同溫度處理后的生長情況見表4。

表4 5株乳酸桿菌在不同溫度處理后的生長情況

經過試驗測定可知，可知對溫度試驗敏感的菌株有RS1，其他菌株經過不同的溫度培養處理后，生長繁殖情況未出現明顯變化。RS5除了在60℃處理后生長很緩慢，其他溫度下處理后都表現出不影響菌株生長的繁殖狀態。

2.1.4 模擬胃腸道耐受試驗

把MRS液體培養基的pH值調至3.0，然后經過115℃滅菌30 min后在無菌超凈臺上操作，添加胃蛋白酶5 mg/mL和5%的NaCl，調配制成模擬人體胃液。把MRS液體培養基pH值調配成8.0，于115℃下滅菌30 min，并放入豬膽鹽為培養基含量0.3%的濃度，無菌超凈臺中操作，添加胰蛋白酶10 mg/mL和0.5%的NaCl，調配制成模擬人體腸液。把試驗菌液以培養基含量為10%的接種量分別加到人體模擬胃腸液中，于37℃恒溫培養箱模擬培養胃液2 h，腸液3 h[10]。

5株乳酸桿菌對模擬胃腸液的耐受性見表5。

表5 5株乳酸桿菌對模擬胃腸液的耐受性/×108CFU·mL-1

由試驗結果可知，5株乳酸桿菌菌株在經過pH值3.0酸度胃液處理2 h后和pH值8.0的腸液處理3 h后，活菌數量均有減少，但是都保持了同步的增長趨勢，由此可以說明5株乳酸桿菌菌株對于模擬的胃液、腸液都具有良好的耐受能力，其中RS3表現較強。

2.1.5 抑菌鑒定試驗

將已經活化好的乳酸桿菌菌株、大腸桿菌和沙門氏菌菌株分別以培養基含量為2%的接種量同時接種10 mL的MRS液體培養基試管中。于37℃恒溫生化培養箱中培養24 h。此次培養運用平板活菌計數的方法，37℃下過夜培養，菌落表現為紅色的大菌落是大腸桿菌菌體，白色的菌落為沙門氏菌[11]。通過記錄大腸桿菌、沙門氏菌的菌落數量，計算每一個試驗菌株對大腸桿菌、沙門氏菌試驗的抑菌率。

5株乳酸桿菌菌株分別對大腸桿菌、沙門氏菌的抑菌作用情況見表6。

表6 5株乳酸桿菌菌株分別對大腸桿菌、沙門氏菌的抑菌作用情況

由試驗數據可知，5株乳酸桿菌菌株與一起培養24 h的大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌率均達了到97%～100%，由此可見，這5株乳酸桿菌對生長在同一微生物環境中的生態具有抑制作用。

2.2 5株雙歧桿菌益生鑒定

2.2.1 分類鑒定程序

對雙歧桿菌屬水平的鑒定過程中，一般常用將經過分離培養純化得到的雙歧桿菌菌株先進行屬水平的鑒定。選擇鏡檢中無分叉的G+桿菌。這些無分叉的G+桿菌經過傳代純化培養后，在pH值4.5的酸度下可生長，經過屬水平的生理生化試驗就可以初步認為是乳酸桿菌。由于對照菌種中的雙歧桿菌特性和這些鑒定結果一樣，可確認為是雙歧桿菌。除了屬水平試驗鑒定，還需進行種水平鑒定，如模擬人體胃腸道等。

2.2.2 基礎試驗鑒定

KOH鑒定試驗：拿起接種環后沒有拉絲現象出現，則判斷試驗菌株雙歧桿菌為KOH陰性菌；吲哚鑒定試驗：在乙醚與培養物之間未產生紅色環狀物，則測試菌株為陰性；需氧鑒定試驗：經接種管培養后，培養液呈清澈，試管底部出現大量菌體沉淀，由此可判斷雙歧桿菌為嚴格厭氧菌；明膠鑒定液化試驗；將經過接種培養的接種管和未接種的對照試管一起置于冰箱中，當對照管凝固時接種管也會凝固，由此可判斷為陰性反應。

2.2.3 雙歧桿菌的生長曲線

在測生長曲線時，將經過活化的5株雙歧桿菌菌株以培養基1%的接種量接種在MRS液體培養基，并于37℃恒溫生化培養箱培養48 h，每2 h取樣測定1次，OD600nm下測定吸光度，繪制生長曲線。

5株雙歧桿菌在37℃時的生長曲線見圖1。

圖1 5株雙歧桿菌在37℃時的生長曲線

由圖1中5株雙歧桿菌的生長曲線可知，屬于正常生長曲線，符合文獻綜述描述。

2.2.4 對雙歧桿菌進行耐酸性菌株的初步篩選試驗

將活化的雙歧桿菌分別接種于改良的MRS液體培養基中，置于37℃恒溫生化培養箱中培養24 h，利用改良的MRS培養液連續傳代培養2～3次后，取10 mL雙歧桿菌培養液，以轉速1 000 r/min離心30 min，收集得到菌體懸液，重復進行1次，加入到盛有5 mL滅菌PBS中振勻得到菌體懸液，再用移液槍吸取菌體懸液0.2 mL接種于5 mL，pH值分別是3.0，3.5和4.0的改良MRS液體培養基中，置于37℃恒溫培養箱中厭氧培養24 h，觀察其生長情況，選擇此條件下生長良好的菌株。

培養基中培養24 h的生長情況見表7。

由表7可知，所選的5株雙歧桿菌均有一定的耐酸性，SQ1在生長中表現最好，可選為優秀菌種進行更深入研究，貯藏待用。

2.2.5 人工胃液鑒定試驗

雙歧桿菌菌體液1.0 mL與pH值為3.0的人工胃液9.0 mL混合后，于37℃下水浴培養，分別在0，3 h后，取樣用MRS瓊脂培養基雙層培養法，測定活菌數并計算其存活率，篩選出存活率在98%以上的菌株，進一步做pH值2.5人工胃液耐受性測定，篩選出存活率在85%以上的菌株進行人工消化液的耐受性測定，然后再進行pH值2.0時的生長測定，每個樣品做3個平行[12]。

表7 培養基中培養24 h的生長情況

5株雙歧桿菌在pH值3.0人工胃液中的生長情況見表8。

表8 5株雙歧桿菌在pH值3.0人工胃液中的生長情況

由表8可知，SQ1生長最好。

2.2.6 耐膽鹽基礎液的制備方法

MRS液體培養基中添加3.0 g/L牛膽鹽和2.0 g/L巰基乙酸鈉，將活化后的菌株按2%接種量接種于膽鹽質量濃度依次為0.3～2.0 g/L的MRS液體培養基中，于37℃下恒溫培養16 h，測出各組菌液的OD600nm。

5株雙歧桿菌對不同質量濃度膽鹽的耐受性見表9。

表9 5株雙歧桿菌對不同質量濃度膽鹽的耐受性

由表9可知，在質量濃度為0.3～2.0 g/L的膽鹽含量對5株雙歧桿菌菌生長均存在抑制，但SQ1表現最好。

2.2.7 模擬胃腸道耐受試驗

配制模擬人體胃液和腸液，將試驗菌液以培養基10%的接種量分別放入模擬人體胃腸液中，放入恒溫生化培養箱中，于37℃條件下，胃液培養2 h，腸液培養3 h[8]。利用平板計數法來統計試驗前后培養液中雙歧桿菌的活菌數量。

5株雙歧桿菌在模擬人體胃液和腸液中2 h消化后的活菌數見表10。

由表10可知，5株雙歧桿菌菌株培養液中都出現了比較顯著的生長現象。其中，SQ1在人工腸液和人工胃液中的耐受性最高，可作為優良的菌株保藏待用，有更多的益生效果可以開發。

表10 5株雙歧桿菌在模擬人體胃液和腸液中2 h消化后的活菌數

3 結論

通過對河南省洛陽市母乳喂養嬰兒糞便進行分離培養，得到具有益生特性的乳酸桿菌和雙歧桿菌純菌種。試驗經過分離培養初步得到5株雙歧桿菌和5株乳酸桿菌。根據進一步的種水平和屬水平的試驗，最終找出了雙歧桿菌和乳酸桿菌各1株具有益生特性的菌種。

對分離的雙歧桿菌菌株和乳酸桿菌株進行更多耐酸和耐氧馴化試驗，使其成為能夠安全食用并應用于生產的優良菌株，為呵護人類健康提供優質的益生菌，將會是未來極具潛力的研究課題。