基于Cajal間質細胞探討電針對逼尿肌反射亢進型神經源性膀胱大鼠的作用機制

李煬，張潤寧，張保平，丁天紅

正常的排尿過程受交感神經、副交感神經、軀體神經系統的控制，由于神經損傷或疾病擾亂正常的排尿過程而引發的疾病稱為神經源性膀胱(Neurogenic bladder, NGB)[1]。在脊髓損傷患者中，排尿功能障礙非常普遍，絕大多數傷者在傷后一年內都有不同程度的泌尿系統功能障礙，其中不足1%的患者能完全康復[2]。神經源性膀胱的康復治療中，針灸已經成為主要手段,且具有療效顯著、安全性高、易被患者接受的特點,在臨床上廣泛應用。有研究發現Cajal間質細胞(interstitial cells of Cajal, ICC)上的C-kit信號通路可能與脊髓損傷后神經源性膀胱發病相關[3]。許明等[4]研究表明電針能減輕脊髓繼發性損傷，保護支配膀胱的神經而改善膀胱功能。本研究進一步研究了電針是否通過作用于膀胱ICC而治療NGB，探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 ①實驗動物與分組：40只健康成年雌性SD大鼠購自西安交通大學動物實驗中心。許可證編號：SCXK(陜)2012-003。體質量220～250g，飼養1周待大鼠適應環境，隨機分為假手術組、對照組、模型組、電針組各10只。②主要試劑與儀器：華佗牌針灸針，電針儀，四通道多功能生理信號放大器，微量灌注泵，激光共聚焦顯微鏡(德國LEICA公司)，羊抗鼠c-kit抗體(Santa Cruz生物技術),兔抗羊二抗(中山公司，中國北京), 辣根過氧化物酶標記的兔抗羊二抗(武漢谷歌生物)，DAPI (武漢谷歌生物)，PVDF膜(millipore)，BCA蛋白定量檢測試劑盒(武漢谷歌生物)等。

1.2 方法 ①造模方法：除對照組外的所有大鼠通過注射10%水合氯醛(300mg/kg)腹膜內誘導全身麻醉。大鼠肋平T13，故以T13作為體表定位標志，骶髓上損傷的脊髓節段為T10～L2 (對應脊柱T8～T12節段)，本實驗統一手術位置為T10。備皮，逐層切開右側皮膚及皮下組織，切口約1～2cm，找到并咬開關節突，暴露脊髓，假手術組不離斷脊髓，而電針、模型組快速切斷，為確保脊髓纖維完全斷開，在兩斷端之間填塞凝膠海綿，逐層縫合肌肉、筋膜、皮膚。術后保暖，至麻醉蘇醒后放大籠中單籠飼養。脊髓橫斷后脊休克期Crede手法輔助排尿(3次/日)；10ml生理鹽水腹腔注射，每日1次，防止脫水；腹腔注射慶大霉素(2mg/kg)預防感染，1次/d，連續7d。若脊髓橫斷后雙后肢有自主活動，術后無尿潴留即出現自主排尿，自噬或死亡，則排除。②干預措施：術后10～14d大鼠渡過脊休克期，于第14天給予電針治療。腧穴定位，次髎[5]：第2、3 骶骨的棘突間隙正中偏上處旁開5～10mm，直刺15mm。將經過手法排尿后的大鼠置于自制簡易電針治療輔助裝置，1.5寸毫針刺入雙側“次髎穴”,深度約為15mm,直至刺入骶2神經孔；電針儀兩個電極分別連接在兩側“次髎穴”的針灸針上，設定為疏密波(密波20Hz，疏波4Hz)，刺激強度以肢體不發生顫動為度。電針時間15 min，連續14d，每天1次。其余3組放置于簡易裝置內15min，不行電針治療。

1.3 檢測項目 ①尿流動力學測定：電針治療14d后行尿流動力學檢測，用10%水合氯醛300mg/kg腹膜誘導麻醉, 手法排空膀胱，借助石蠟油將硬膜外導管經尿道輕導入大鼠膀胱，通過三通管將導好的尿管、微量注射泵、尿流動力學分析儀連接，以0.2ml/min的速率進行輸注溫鹽水(37℃～38℃)進行膀胱測壓。并記錄膀胱壓力和收縮頻率曲線。②Western blotting：取大約100mg膀胱壁組織，切碎，均質化和解離進入放射性免疫沉淀測定裂解緩沖液中，4℃ 30min。4℃，12kg，離心5min，收集上清液并用作總蛋白質。取上清液2ul，用BCA法進行蛋白定量。蛋白質通過SDS-PAGE電泳并轉移到PVDF膜，封閉1h，加入羊抗鼠c-kit抗體(1：200，Santa Cruz Biotechnology)，在4℃孵育過夜。洗滌3次，后加辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫下孵育30min后，洗滌3次。ECL成像和Alpha軟件系統用于處理目標帶的光密度值。③免疫熒光：切下的膀胱壁組織用4%多聚甲醛固定，將固定的組織切成小塊，冷凍保存，切片(5mm)，然后與山羊抗鼠c-kit抗體(1：100稀釋)一起溫育2h。洗去未結合的一抗，將切片稍微干燥，加入兔抗羊二抗(1：200稀釋)室溫避光孵育50min。洗滌， DAPI染液進行核染色，黑暗下室溫孵育10min。清洗切片，封片。標本成像使用激光共焦顯微鏡觀察，每個標本隨機選取3個視野，用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件分析，計算每個視野ICC數量。

2 結果

2.1 一般情況 術后1只自噬，1只后肢有自主運動，均不納入實驗。造模后14d有18只大鼠符合模型要求。模型組、電針組較對照組、假手術組排尿次數增加(籠內墊料更潮濕，且會陰部皮毛長時間處于潮濕狀態)，飲食減少，體重下降。

2.2 尿流動力學檢測 與對照組和假手術組比較，模型組和電針組膀胱最大容量及膀胱順應性均降低(P<0.05)，膀胱基礎壓力和漏尿點壓力增加(P<0.05)。與模型組比較，電針組的膀胱最大容量及膀胱順應性明顯增加(P<0.05)，膀胱基礎壓力和漏尿點壓力降低(P<0.05)。對照組與假手術組各項無顯著性差異。見表1。

表1 尿流動力學檢測結果

與對照組和假手術組比較，aP<0.05。與模型組比較，bP<0.05

2.3 C-kit蛋白的表達 對照組C-kit蛋白相對表達量為(0.38±0.19)，假手術組為(0.37±0.16)，模型組為(0.86±0.06)，電針組為(0.68±0.14)，組間差異有統計學意義(F=23.99，P<0.01)；其中，模型組較對照組C-kit蛋白相對表達量增高(t=-7.43，P<0.01)；電針組較模型組C-kit蛋白相對表達量降低(t=3.48，P<0.01)，見圖1。

模型組 電針組 假手術組 對照組

2.4 膀胱ICC數量 鏡下觀察到的ICC如圖2所示。對照組膀胱ICC數量為(3.3±0.9)，假手術組為(4.1±1.2)，模型組為(9.0±2.0)，治療組為(6.0±1.2)，組間差異有統計學意義(F=30.61，P<0.01)；其中模型組較對照組增多(t=7.58，P<0.01)，治療組較模型組減少(t=3.82，P<0.01)。

a.對照組(×300) b.假手術組(×300)

c.模型組(×300) d.電針組(×300)

3 討論

祖國醫學認為脊髓損傷后尿失禁相當于“遺溺”“小便不禁”范疇，《素問·靈蘭秘典論》云:"膀胱者,州都之官,津液藏焉,氣化則能出矣，故"遺溺"原因多是膀胱氣化不利所致。次髎穴屬膀胱經，進行電針干預調節膀胱氣化功能而達到治療“遺溺”的目的?，F代醫學認為急性骶上脊髓損傷最初伴隨著脊髓休克[6,18]，在此期間膀胱是無反射的，數周后出現脊髓反射通路，導致逼尿肌過度活動和潛在的逼尿肌-括約肌協同失調。大鼠交感神經的低級中樞在脊髓L1～L2節段，副交感神經和軀體神經的低級中樞均在脊髓L6～S1節段[7-8]。研究表明電刺激L6腹側根在產生逼尿肌收縮方面最有效，而S1背根最能抑制排尿反射[19]。骶神經調節的動物實驗研究表明將電刺激導管置于S1、S2、S3孔可以治療大鼠膀胱功能障礙[9-10]，電針S2孔的次髎穴其直接作用是刺激骶神經調節排尿反射而改善膀胱功能[11]。實驗中，電針組的膀胱最大容量及膀胱順應性較模型組增加，膀胱基礎壓力和漏尿點壓力降。表明電針次髎穴對神經源性膀胱的療效是確切的，但是下游機制還需進一步探討。

ICC是在人體具有蠕動活性器官中發現的起搏細胞，它們可以在神經信號傳輸至平滑肌細胞的過程中起到起搏器或中間體的作用[12]。一些研究表明ICCs廣泛分布于動物尿道[13,14],雖然胃腸和膀胱ICC似乎具有相同的形態和受體表達，但它們的功能不同。C-kit是酪氨酸激酶受體蛋白家族的重要成員之一，是一種跨膜蛋白，是ICC的特異性標志物。c-kit蛋白及其配體干細胞因子(stem cell factor,SCF)構成C-kit/SCF信號系統與ICCs的增殖、分化和維持密切相關，阻斷c-kit受體可降低逼尿肌平滑肌的自發興奮性及離子通道活性，且可觀察到ICC的數量可逆地減少[3,15,17]。我們觀察到模型組c-kit蛋白相對表達量增多、ICC數量增多，膀胱出現無抑制收縮；電針治療后電針組ICC數量、c-kit蛋白相對表達量較模型組下降，膀胱功能得到改善。說明膀胱的不同功能狀態可能與ICC數量及c-kit蛋白表達的變化有關，這與其他實驗結果一致[3,16]。因此，C-kit的表達與ICC數量變化密切相關，至于C-kit蛋白的表達是如何變化的，其機制是什么，尚需實驗研究進一步證實。

綜上，我們認為電針次髎穴治療神經源性膀胱其作用機制之一可能是通過抑制C-kit表達，減少ICC數量而減少了逼尿肌興奮的啟動來源，降低逼尿肌的興奮性，減少膀胱的無抑制收縮。至于是如何降低ICC數量及c-kit蛋白表達，通過何種方式降低，其作用機制還需進一步的實驗研究。