HPLC法測定棘豆止咳散中甘草苷的含量

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1.內(nèi)蒙古蒙醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院， 內(nèi)蒙古 通遼 028000；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)庫倫旗蒙醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 庫倫旗 028000

棘豆止咳散為內(nèi)蒙古通遼市庫倫旗蒙醫(yī)醫(yī)院的醫(yī)院制劑，由甘草、川貝母、多葉棘豆、石膏4味藥組成。其中，葉棘豆為君藥、川貝母為臣藥、甘草為使藥、石膏為佐藥，該藥對于多種咳嗽均具有明顯療效，老人和兒童均可使用[1]。甘草作為其中一味重要組成藥味，為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.脹果甘草GlycyrrhizainflataBat.或光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根和根莖[2]。甘草自古以來就作為鎮(zhèn)咳藥廣泛應(yīng)用[3-4]。甘草中含有皂苷和黃酮兩大類成分[5-6]，已有研究表明黃酮類成分具有顯著的鎮(zhèn)咳作用[7-8]。本實驗采用HPLC法對棘豆止咳散中藥效成分甘草苷的含量進行了測定，并進行了方法學(xué)考察。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-20AT 手動高效液相色譜儀(島津)；BS224 S分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；FW-177高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；HW-526數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 材料 95%乙醇(天津市永大化學(xué)有限公司)；乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。多葉棘豆(批號：1807046)、甘草(批號：170628)、川貝母(批號：1701036)、生石膏(批號：1703067)等藥材均由赤峰榮興堂藥業(yè)有限責(zé)任公司蒙中藥飲片廠提供；甘草苷對照品(批號：111610-201607，中國食品藥品檢定研究院)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：X Terra MSC18(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)；流動性：A相為乙腈，B相為0.05%磷酸水，按表1規(guī)定進行梯度洗脫；檢測波長：237 nm；柱溫：40℃；流速：1.0 mL/min；檢測時間：40 min；進樣量：10 μL。在上述條件下，供試品溶液中甘草苷的吸收峰與其他相關(guān)峰均能達到較好分離，分離度大于1.5，理論塔板數(shù)以甘草苷計不低于2000。按棘豆止咳散處方制備工藝自制不含甘草藥材的陰性供試品溶液，按上述色譜條件進樣，結(jié)果陰性供試品溶液對樣品測定無干擾。色譜圖如圖1所示。

表1 流動性梯度洗脫表

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取甘草苷對照品，精密稱定，加70%乙醇制成每1 mL含甘草苷0.1 mg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取由甘草、川貝母、多葉棘豆、石膏(2∶1∶2∶1)比例制備的散劑粉末(過100目篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇30 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 線性關(guān)系考察 精密稱量甘草苷對照品1.08 mg定容于10 mL容量瓶中，加70%乙醇溶液使其溶解，并稀釋至刻度，得其甘草苷濃度為0.108 mg/mL。分別精密吸取5、7.5、10、12.5、15 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件進行測定，結(jié)果見下表2，以對照品吸收峰面積為縱坐標(biāo)Y，進樣量(μL)為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖2所示。

表2 甘草苷線性關(guān)系考察

其中R2=0.9993，說明甘草苷在該范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗 精密吸取“2.3”項下對照品溶液，同一天內(nèi)連續(xù)進樣6針，精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件進行測定，結(jié)果見下表，根據(jù)其峰面積計算其RSD值為0.502%，表明該儀器精密度良好，見表3。

表3 精密度實驗試驗結(jié)果

2.5 重復(fù)性試驗 精密稱量取同一批棘豆止咳散散劑粉末6份，分別按照“2.2.2”供試品溶液制備方法制備，按“2.1”項下色譜條件進行測定，同一天內(nèi)連續(xù)進樣6針，精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀測定，結(jié)果見下表，根據(jù)其峰面積計算其RSD值為0.632%，表明方法重復(fù)性良好。見表4。

表4 重復(fù)性試驗結(jié)果

2.6 穩(wěn)定性試驗 按“2.1”項下色譜條件進行測定，精密稱取同一批棘豆止咳散散劑粉末一份，按照“2.2.2”供試品溶液制備方法制備，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀測定，結(jié)果見表5，根據(jù)其峰面積計算其RSD值為2.849%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表5 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.7 回收率試驗 精密稱量甘草苷對照品10.06 mg定容于10 mL容量瓶中，加70%乙醇溶液使其溶解，并稀釋至刻度，得其甘草苷濃度為1.006 mg/mL。精密稱取同一批棘豆止咳散散劑粉末9份，每份0.25 g左右，在其中加入甘草苷對照品0.5 mL、1 mL、1.5 mL每組三份，共九份。按照“2.2.2”供試品溶液制備方法制備，按“2.1”項下色譜條件，精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀測定，結(jié)果見表6，根據(jù)其回收率計算其RSD值為2.968%。

2.8 樣品測定 分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀測定，計算得到棘豆止咳散散劑中甘草苷的含量為0.3526%。

3 討論

《傳統(tǒng)蒙藥與方劑》[9]中記載，多葉棘豆有殺粘、清熱、燥協(xié)日烏素、愈傷、生肌、鎖邁止血、消腫的功效。川貝母為傳統(tǒng)的止咳化痰良藥，相關(guān)報道[10-12]指出：黏稠的痰會造成呼吸道阻塞而感染，并刺激呼吸道引起咳嗽，川貝母可降低痰液黏稠度，同時對平滑肌有松弛作用，有良好的祛痰作用。甘草為一種使用很廣泛的中草藥，主要功效益氣補中、去痰止咳、解毒、緩急止痛、調(diào)和藥效等[13]。相關(guān)研究[14]指出，服用甘草后，其通過緩和炎性刺激達到鎮(zhèn)咳效果，并促進支氣管黏膜分泌使痰咳出。石膏為中醫(yī)臨床常用藥，具有清熱瀉火，抗病毒等功效。棘豆止咳散廣泛應(yīng)用于臨床，治療巴達干、其素偏盛性肺病、哮喘等疾病。綜上所述，棘豆止咳散的傳統(tǒng)應(yīng)用與現(xiàn)代研究結(jié)果有很多的相關(guān)之處和一致性，為后期棘豆止咳散的開發(fā)研究奠定實驗基礎(chǔ)。

表6 樣品含量測定結(jié)果

由于多葉棘豆只有部頒標(biāo)準(zhǔn)，未有中國藥典標(biāo)準(zhǔn)，研究尚不明確。川貝母在棘豆止咳散中的比例小，指標(biāo)成分含量小，暫時尚未研究。石膏其主要化學(xué)成分是硫酸鈣，所以本實驗暫不研究。因此，本實驗選擇了甘草中的甘草苷作為研究對象。這只是初步研究，筆者團隊接下來會進一步研究棘豆止咳散中的其他成分，為棘豆止咳散的質(zhì)量控制做出依據(jù)。

本實驗還比較了甲醇-水、乙腈-水的梯度洗脫系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)以乙腈-水為流動性，檢測波長為237 nm時，被測組分的分離效果好，分離度符合要求。從表2可以看出，其r2=0.9993，說明甘草苷在該范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。從表3～5可以看出，其精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性的RSD值均小于3.0%，其回收率在90.19%～97.87%，建立的方法學(xué)考察指標(biāo)均符合藥典規(guī)定，上述結(jié)果表明該實驗所建立的含量測定方法簡便，可靠，重復(fù)性好，可用于棘豆止咳散的質(zhì)量控制，為該制劑的質(zhì)量評價及深層次開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。