五味沙棘泡騰片的提取工藝考察

楊 靜 阿古拉

內蒙古醫科大學藥學院，內蒙古 呼和浩特 010100

五味沙棘方是蒙藏醫臨床常用的傳統方藥之一，全方由沙棘膏、木香、白葡萄干、甘草、梔子5味藥組成, 沙棘膏為方中君藥,含多種黃酮化合物,主要有異鼠李素、異鼠李素-3-β-D-葡萄糖苷、異鼠李素-3-β-D-蕓香糖苷、槲皮素、山奈素。方中以味酸,性溫,銳而有止咳、祛痰、除巴達干功效的沙棘膏為主;以排膿、祛痰的木香為輔,配以白葡萄干以清肺熱、止咳、平喘,甘草以清熱,止咳、祛痰,梔子以清血熱為之佐使。功能主治清熱祛痰、止咳定喘,臨床用于肺熱久咳、喘促痰多、胸中滿悶等。現行2015年版《中國藥典》一部收載有五味沙棘散,且其質量標準較為完善[1]，市場上已有五味沙棘顆粒、五味沙棘含片及五味沙棘口服液等，但有關泡騰片質量標準的研究尚未見報道。鑒于此將其制成迅速溶解，吸收迅速，便于患者服用的口服泡騰片劑型。蒙藏醫臨床常用的傳統方藥，采用水平正交試驗法，以方中君藥沙棘膏中槲皮素、山柰素、異鼠李素的總量作為提取工藝的評價指標，來優化提取工藝。

1 儀器與試藥

島津LC-20A型高效液相色譜儀(SPD-M20A二極管陣列檢測器、CBM-20A型控制器、CTO-20A柱溫箱、LC-20AT型輸液泵、SIL-20A型自動進樣器、LC solution色譜數據工作站、DGU-20A5型脫氣機)，電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)，旋轉蒸發儀(瑞士步琦有限公司)，HH-D4型數控恒溫水浴鍋(金壇市雙捷實驗儀器廠)，甲醇、磷酸(天津市盛奧化學試劑有限公司)、乙醇(國藥集團化學試劑有限公司)，色譜甲醇(SIGMA-ALDRICH),水為超純水，槲皮素、山柰素、異鼠李素(中國食品藥品檢定研究院)，中藥材(內蒙古天力藥業有限公司)

2 方法與結果

2.1 正交試驗優選提取工藝條件 由于處方中多數藥材的已知有效成分在乙醇中具有較好的溶解性[2-6]。故采用單因素考察后，選用L9(34)水平正交試驗，以槲皮素、山柰素和異鼠李素含量對工藝進行優化，所確定的正交因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平

2.2 槲皮素、山柰素和異鼠李素的含量測定

2.2.1 色譜條件 采用Agilent C18色譜柱(250mm×4.6mm),5 μm;流動相為甲醇：0.4%磷酸水溶液(65∶35)，流速1 mL·min-1，柱溫35℃，檢測波長370 nm，進樣10 μL。

2.2.2 供試品溶液 取五味沙棘方中除木香外的其余四味藥,精密稱定, 置圓底燒瓶中, 精密加入8倍量的75%乙醇, 加熱回流l h,提取2次, 濾過放冷, 用旋轉蒸餾儀回收乙醇后將藥液定容于100 mL容量瓶中備用。精密量取25 mL，置具塞錐形瓶中, 加鹽酸3.5 mL， 加熱回流水解1 h, 立即冷卻, 移至50 mL量瓶中, 用適量75%乙醇洗滌容器,洗液并入同一量瓶中,加75%乙醇至刻度,搖勻,濾過,即得。

2.2.3 對照品溶液的制備 精密稱取槲皮素3.559 mg、山柰素2.534 mg、異鼠李素3.021 mg分別置于100 mL、100 mL、10 mL容量瓶中用甲醇溶解并定容，搖勻，濾過，即得對照品溶液

2.2.4 陰性對照試驗 陰性對照提取液(處方中缺沙棘膏藥材),按提取物測定液的制備方法制備供試液,進樣測定。結果表明其色譜在槲皮素、山柰素、異鼠李素相應保留時間無峰，如圖1所示。說明處方中其他成分對測定結果無干擾。

2.2.5 線性關系考察 精密吸取“2.2.3”節下混合對照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，注入高效液相色譜儀，按“2.2.1”節下色譜條件進行測定，以進樣量對峰面積積分值進行回歸分析，所得結果見表2，3種黃酮在所測定范圍內呈良好的線性關系。

表2 3種黃酮線性關系

2.2.6 精密度試驗 精密吸取標準品溶液10 μL進樣,按2.2.1項下重復進樣6次,測得槲皮素、山柰素和異鼠李素的峰面積積分值,計算RSD分別為0.65%、0.74%、0.86%。表明方法精密度良好。

2.2.7 穩定性試驗 取提取液測定液，按0、2、4、6、8 h不同時間間隔進樣，測得槲皮素、山柰素和異鼠李素的峰面積積分值，計算RSD分別為1.03%、1.15%、1.52%，結果表明提取物測定液中槲皮素、山柰素和異鼠李素在8 h內穩定。

2.2.8 重復性試驗 分別稱取樣品5份，按供試品溶液制備方法平行制備5份溶液，進樣10 μL，測定峰面積，連續進樣2次，計算槲皮素、山柰素、異鼠李素含量的RSD分別為0.77%、0.57%、0.77%。結果表明本方法重復性良好。

2.2.9 回收率試驗 精密稱取已測知含量的五味沙棘提取物的樣品,分別加入不同質量的槲皮素(見表3)山柰素(見表4)異鼠李素(見表5)對照品,按樣品溶液的制備方法制備樣品,測定其含量,計算回收率。

表3 槲皮素對照品

表4 山柰素對照品

表5 異鼠李素對照品

2.10 提取物含量測定 精密吸取正交試驗各試驗號提取液測定液10 μL,按上述色譜條件依次進樣,測定槲皮素、山柰素、異鼠李素峰面積積分值如圖1所示；經計算槲皮素、山柰素、異鼠李素的含量見表6。

2.3 試驗結果分析 采用綜合平衡法對試驗結果進行極差分析和方差分析(SPSS統計軟件),結果見表6、表7。由表6中的R值可知，以槲皮素、山柰素、異鼠李素的總含量為指標時，影響因素的大小順序均為A>C>D>B。說明溶劑濃度和提取時間是重要因素，提取次數和溶劑倍數次之。由方差分析結果可知，因素A、C對總含量的影響均有顯著性。結合極差分析，并按生產實際中降低消耗，提高效率的原則，確定五味沙棘泡騰片較優的提取工藝條件為A2B3C1D2，即加入75%乙醇8倍量，提取2次，每次1 h。

表7 主旨間效果檢定 因變數: VAR00001

注：a.R2=0 .870(調整的R2=0.755)。

2.4 提取工藝的驗證 按上述較優的工藝進行試驗驗證(n=6)，結合槲皮素、山柰素、異鼠李素總含量的平均值為3.6300 mg/g，表明所確定的較優工藝合理可行。

3 討論

考慮到槲皮素、山柰素、異鼠李素的化學性質，在進行提取工藝條件的考察時，采用了65%乙醇、75%乙醇、85%乙醇 、95%乙醇作為溶媒進行回流提取。結果表明，75%乙醇較優，考慮到濃度為影響因素，故以70%、75%、80%為提取溶劑濃度進行正交試驗考察。根據文獻報道沙棘膏中黃酮類化合物大多數以糖苷的形式存在，主要以槲皮素苷、山柰素苷、異鼠李素苷。如果直接測槲皮素、山柰素、異鼠李素的含量發現及其低，難以反映黃酮類化合物的真實含量，因此試驗中采取酸水解后測定槲皮素、山柰素、異鼠李素的含量。為了盡可能短時間內獲得較好的分離效果，對色譜條件進行優化，考察了不同組成的流動相，如乙腈—水、甲醇—水、甲醇—酸系統，酸比較了磷酸和冰醋酸。結果表明磷酸可以減少色譜峰拖尾，使色譜峰達到較高的對稱性，改善了分離度，最終確定下條件為甲醇—0.4%磷酸水溶液為流動相，峰形對稱，無拖尾現象，槲皮素保留時間為14 min左右，山柰素保留時間為23 min左右，異鼠李素保留時間在27 min左右。

4 小結

在五味沙棘泡騰片的研制過程中,根據方中各味藥材中主要有效部位或有效成分的理化性質,確實了五味沙棘泡騰片的工藝路線。采用正交試驗法對醇提工藝進行優化，以槲皮素、山柰素和異鼠李素的總量為指標，優選了最佳煎煮工藝條件。通過劑型改進，對全粉末的五味沙棘散中全部藥材進行了提取，減少了服藥量，有助于有效部位或有效成分的溶出和吸收，加快了藥品的起效速度，同時便于服用、攜帶和貯藏，為患者提供了一種全新的給藥選擇方案。

對于蒙藥的標準建立為今天蒙醫藥的發展奠定堅實的理論基礎，從而強化蒙醫藥在防病、治病、保護和增進人民群眾的健康事業中發揮獨特的、重要的和不可替代的作用，從而形成保持蒙醫藥特色的標準體系，建立規范的、科學的蒙藥材內在的質量控制體系，保證蒙藥制劑的質量。