解沒食子酸鏈球菌代謝產物對結腸癌細胞生長的調控作用及其機制研究

任建峰 張其勝 王 慧 陸穎影 靖大道#

上海交通大學附屬第一人民醫院消化科1(200080) 上海市第四人民醫院消化科2

背景：解沒食子酸鏈球菌(SG)可能通過其代謝產物改變結腸微環境，使人體轉變為傾向腫瘤形成的高危狀態。目的：探討SG代謝產物(SGM)對結腸癌細胞生長的調控作用及其機制。方法：常規培養人結腸癌細胞株SW620，并分為空白組(A組)、健康人腸道菌群組(B組)、雙歧桿菌代謝產物組(C組)、SGM組(D組)和雙歧桿菌代謝產物+SGM組(E組)。采用CCK-8法檢測細胞增殖能力，細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力，蛋白質印跡法檢測β-catenin蛋白表達，實時PCR法檢測c-myc mRNA表達。結果：與A組、B組、C組相比，D組、E組細胞增殖活力顯著升高(P<0.05)，細胞遷移能力顯著升高(P<0.05)，β-catenin蛋白表達顯著升高(P<0.05)，c-myc mRNA表達顯著升高(P<0.05)；而D組與E組上述指標相比無明顯差異(P>0.05)。結論：SG可通過其代謝產物增強結腸癌細胞的增殖、遷移能力，該作用可能是通過激活Wnt/β-catenin信號通路而實現的。而聯合雙歧桿菌代謝產物并不能抑制SGM對結腸癌細胞增殖和遷移的促進作用。

結直腸癌是人類第三大癌癥，也是導致癌癥相關死亡的第四大常見原因[1]。結直腸癌的發病是一個多因素、多步驟、多途徑的過程，涉及進行性分子遺傳學改變和相關的組織形態學改變。其發生、發展的原因尚不清楚，可能是遺傳與環境因素共同作用的結果[2]。人類腸道環境復雜，細菌、真菌與病毒共存，數量高達100萬億，是人類細胞的10倍。生理情況下，腸道細菌參與人體多種基本生理活動，如促進腸道發育成熟、調節人體對營養物質的消化和吸收、抵抗病原體的入侵等[3]。腸道菌群的穩態一旦被破壞，可導致種疾病，甚至某些腸道菌群可能通過信號通路機制參與結直腸癌的發生、發展。

近年來，已有越來越多的研究結果證實牛鏈球菌(Streptococcusbovis)感染與結直腸癌的發生有關[4-6]，其在腫瘤微環境中具有增殖優勢，而在健康腸道中的感染能力較弱，但具體的致癌機制目前尚未完全清楚。解沒食子酸鏈球菌(Streptococcusgallolyticus, SG)屬牛鏈球菌，與其他種類相比，SG更有可能參與結直腸癌的發生、發展[7]。本研究通過觀察解沒食子酸鏈球菌代謝產物(Streptococcusgallolyticusmetabolites, SGM)對人結腸癌細胞株SW620生長、遷移的影響，旨在探討其與結腸癌發生、發展的關系及其可能的作用機制。

材料與方法

一、主要材料與儀器

SG由上海生物科學研究院惠贈，從樹袋熊的排泄物中分離，由Micro Scan Auto SCAN4微生物分析儀鑒定結果為SG(概率：99%)；雙歧桿菌(CICC-6071)購于北京中科質檢生物技術有限公司，置于BHI培養基中培養。人結腸癌細胞株SW620購自上海信裕生物科技有限公司；CCK-8檢測試劑盒購自北京鼎國生物昌盛技術有限責任公司；β-actin抗體(工作濃度為1∶500)、β-catenin抗體 (工作濃度為1∶1 000)、IgG二抗(工作濃度為1∶500)購自美國Santa Cruz公司。

Step One Plus熒光實時定量PCR擴增儀(Applied Biosystems)； VM-10 WiseMix VM 渦旋振蕩器；SDS-PAGE電泳儀、Universal hood Ⅱ化學發光成像儀(Bio-Rad)。

二、方法

1. 細菌培養和代謝產物提取

①健康人腸道菌群的分離培養：將1 g健康志愿者(否認家族性遺傳疾病史，完善內鏡、生化等各項檢查，結果均正常)糞便接種至庖肉培養基中，37 ℃培養3～5 d。無菌紗布過濾， 14 000 r/min離心15 min，去上清。稱取1 g細菌備用，剩余細菌以無菌純甘油重懸后-80 ℃保存待測。

②細菌代謝產物的提取：將1 g細菌接種于200 mL DMEM/F12培養基中，37 ℃培養3 d；14 000 r/min 離心15 min，取上清，-80 ℃保存待測。

2. 細胞培養和分組：人結腸癌細胞株SW620常規傳代培養。取對數生長期細胞，制備成細胞懸液，并分為空白組(A組)、健康人腸道菌群組(B組)、雙歧桿菌代謝產物組(C組)、SGM組(D組)和雙歧桿菌代謝產物+SGM組(E組)，A組僅加入培養基，B、C、D組分別按體積比加入相應的5%細菌代謝產物，E組加入各5%的雙歧桿菌代謝產物和SGM。

3. 結腸癌細胞增殖的檢測：取各組對數生長期細胞1×105個/mL，接種于96孔培養板上，每孔100 μL，每組設15復孔。37 ℃ 5% CO2培養箱繼續培養。待細胞完全貼壁后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，繼續培養24、48、72 h，上酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度(A)值，繪制細胞生長曲線。

4. 結腸癌細胞遷移的檢測：在6孔板背后均勻劃橫線，間隔0.5 cm，每孔至少穿過5條線。取各組對數生長期細胞5×106個/mL，制備成細胞懸液，接種于6孔板上，每孔100 μL，培養24 h。PBS洗3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養基，37 ℃ 5% CO2培養24 h后取樣，拍照，觀察細胞遷移情況。

5. 蛋白質印跡法檢測β-catenin蛋白表達：取各組對數生長期細胞，制備成細胞懸液，RIPA裂解液裂解細胞，提取總蛋白，Lowry法測定蛋白濃度。取總蛋白40 μg上樣，30～50 mA恒流進行電泳跑膠。使用濕轉法將分離膠上的蛋白轉到硝酸纖維素膜上，100 V恒壓90 min后轉膜。5%脫脂奶粉封閉1 h，洗滌，加入β-catenin抗體、β-actin抗體4 ℃孵育過夜；PBST洗膜5 min×3次，加入IgG二抗室溫孵育約1 h，PBST洗膜5 min×3次。ECL法顯色。計算目的蛋白的相對表達量。

6. 實時定量PCR法檢測c-myc mRNA表達：行預實驗檢測引物擴增的Ct值和融解曲線。取各組細胞RNA，逆轉錄合成cDNA，行PCR反應。c-myc引物上游：5’-TCA GAG AAG CTG GCC TCC TA-3’，下游：5’-TCC AGC AGA AGG TGA TCC AGA-3；以β-actin作為內參，引物上游：5’-TTC GAG CAG GAA TCT GAC ACA T-3’，下游：5’-CAA TGA TGG CTG GAA GAG GAC-3’。PCR反應體積共20 μL，內含SYBR?Green Realtime PCR Master Mix(2x)10 μL、10 μmol/L上、下游引物各1 μL、模板cDNA 2 μL、RNase Free ddH2O 6 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸1 min，共40個循環；60～95 ℃緩慢升溫，融解曲線信號檢測30 min。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的mRNA相對表達量。

三、統計學分析

結 果

一、細胞增殖情況

CCK-8法顯示，培養48 h、72 h后，D組細胞增殖活力均顯著高于A組、B組和C組(P<0.05)，說明SGM具有更強的促進SW620細胞增殖的能力。E組細胞增殖活力均顯著高于A組、B組和C組(P<0.05)，而B組、C組細胞增殖活力與A組相比無明顯差異(P>0.05)，D組與E組相比亦無明顯差異(圖1、表1)。提示聯合雙歧桿菌代謝產物并不能降低或抑制SGM的促細胞增殖能力。

二、細胞遷移情況

細胞劃痕實驗顯示，SW620細胞培養24 h后，D組細胞遷移距離顯著高于A組、B組和C組(P<0.05)，提示SGM具有更強的促進SW620細胞遷移的能力。同時，E組細胞遷移距離顯著高于A組、B組、C組(P<0.05)，而B組、C組細胞遷移距離與A組相比無明顯差異(P>0.05)；D組與E組之間細胞遷移距離相比亦無明顯差異(P>0.05)(圖2、表2)。提示聯合雙歧桿菌代謝產物并不能降低或抑制SGM促進SW620細胞遷移的能力。

三、β-catenin蛋白表達情況

蛋白質印跡法結果顯示，D組β-catenin蛋白表達顯著高于A組、B組和C組(P<0.05)， 提示SGM可能通過激活Wnt信號通路，進一步調控下游腫瘤相關基因的表達。同時，E組β-catenin蛋白表達顯著高于A組、B組和C組(P<0.05)，而B組、C組β-catenin蛋白表達與A組相比無明顯差異(P>0.05)；D組與E組之間β-catenin蛋白表達亦無明顯差異(P>0.05)(圖3、表2)。提示聯合雙歧桿菌代謝產物并不能降低或抑制SGM激活Wnt信號通路的能力。

圖1 不同代謝產物對SW620細胞增殖活力的影響

組別24 h48 h72 hA組0.14±0.060.25±0.020.51±0.17B組0.10±0.020.27±0.070.65±0.28C組0.12±0.030.30±0.070.59±0.27D組0.26±0.080.76±0.17?1.25±0.10?E組0.28±0.100.74±0.10?1.19±0.05?

*與相應時間點的A、B、C組比較，P<0.05

圖2 不同代謝產物對SW620細胞遷移能力的影響(細胞劃痕實驗)

組別遷移距離(μm)β-catenin蛋白c-myc mRNAA組9.93±8.210.42±0.121.84±0.12B組15.92±5.270.47±0.091.87±0.10C組14.96±6.240.53±0.171.92±0.07D組31.78±4.04?1.47±0.14?6.21±0.24?E組32.64±2.90?1.30±0.11?6.09±0.33?

*與A、B、C組比較，P<0.05

四、c-myc mRNA表達情況

定量PCR法結果顯示，D組c-myc mRNA表達顯著高于A組、B組和C組(P<0.05)，提示SGM可促進Wnt信號通路下游腫瘤相關靶基因c-myc mRNA表達。同時，E組c-myc mRNA表達亦顯著高于A組、B組和C組(P<0.05)，而B組、C組c-myc mRNA表達與A組相比無明顯差異(P>0.05)；D組與E組之間c-myc mRNA表達水平亦無明顯差異(P>0.05)(圖4、表2)。提示聯合雙歧桿菌代謝產物并不能降低或抑制SGM促進c-myc mRNA表達的能力。

圖3 不同細菌代謝產物對SW620細胞中β-catenin蛋白表達的影響(蛋白質印跡法)

圖4 各組SW620細胞中c-myc mRNA表達情況(定量PCR法)

討 論

腸道微生態與結直腸癌的發生、發展有密切關系，腸道菌群在生理條件下一般保持動態平衡，一旦該平衡被打破，可能會引起各種腸道疾病的發生、發展。腸道菌群及其代謝產物作為環境因子，通過調控相關基因的表達，在結直腸癌中發揮重要作用[8]，可直接或間接促進結直腸癌的發生、發展[9]。牛鏈球菌是第一個被發現與結腸癌發生相關的細菌，McCoy等于1951年報道了第一例與牛鏈球菌感染性心內膜炎相關的結直腸癌[10]。牛鏈球菌包括許多亞種，其中SG與結直腸癌的相關性最強，相關研究顯示，SG感染患者結直腸癌、腺瘤的發生風險升高，是引起結腸癌的主要細菌之一[11-16]。

SG感染患者的結腸直腸癌和腺瘤的發生風險顯著升高，提示SG在腫瘤的發展過程中發揮積極作用，但其作用機制目前尚不清楚。Kumar等[17]將SG與不同細胞株共培養，發現SG可能通過β-catenin對一些結腸癌細胞起促進生長和增殖的能力，且SG可促進小鼠結直腸癌模型腫瘤的生長。該研究認為SG感染促進人結腸癌細胞增殖的方式取決于細胞環境、細菌生長階段和細菌與結腸癌細胞之間的直接接觸。本研究應用SGM處理人結腸癌SW620細胞，結果顯示細胞增殖能力顯著高于空白組、健康人腸道菌群和雙歧桿菌代謝產物組，提示SG可通過其代謝產物促進結腸癌細胞增殖，而無需與細胞直接接觸。此外，本研究還發現，SGM組細胞增殖與雙歧桿菌代謝產物+SGM組相比無明顯差異，提示SGM促進細胞增殖的作用并未被雙歧桿菌代謝產物所抑制。

腸道微生物構成的變化可誘導炎癥微環境的形成，其代謝產物可能促進結腸癌的發生和轉移。癌癥的重要特征之一是細胞惡性增殖和轉移，表現為細胞運動能力的提高。本研究發現，SGM具有更強的促進細胞遷移的能力，且雙歧桿菌代謝產物并不能抑制這種作用，提示SG可能在結腸癌轉移過程中也起有促進作用。

Wnt/β-catenin信號通路具有調節細胞增殖、極性、胚胎發育過程和組織內穩態的作用，其異常激活可導致包括腫瘤在內的多種疾病的發生[18-19]。β-catenin、c-myc是Wnt/β-catenin信號通路核心的下游靶基因，其過表達可增強DNA復制能力，促進DNA增殖[20]。本研究結果顯示，SGM組和雙歧桿菌代謝產物+SGM組β-catenin蛋白表達、c-myc mRNA表達均明顯高于其余三個組別，提示SGM可激活Wnt信號通路，且雙歧桿菌代謝產物并不能抑制這種激活，并可能進一步調控下游腫瘤相關基因的表達。

綜上所述，本研究從細胞增殖、Wnt信號通路的關鍵蛋白β-catenin蛋白表達以及下游分子c-myc mRNA表達上闡述了SGM對人結腸癌SW620細胞增殖、遷移的調控作用，為腸道微生物與結腸癌發生、發展機制的研究奠定了一定的實驗基礎。下一步應從腫瘤組織標本中進一步探討SG與結腸癌發生、發展的關系，以期為結腸癌的防治探索一種新的生物靶點。