CLEC4D、CARD9在炎癥性腸病中的表達及其作用*

杜曉博 趙美華 馬 娜 高 闖 楊貝貝 王丹丹 耿 麗 王許平 馮百歲

鄭州大學第二附屬醫院消化內科 吳階平醫學基金會中國炎癥性腸病聯盟河南省炎癥性腸病中心(450014)

背景：C型凝集素結構域家族4成員D(CLEC4D)在系統性真菌感染中可誘導Th17細胞分化，調控IL-17A表達，目前國內外尚未見其在腸道免疫中是否發揮作用的報道。目的：探討CLEC4D、CARD9在炎癥性腸病(IBD)患者結腸組織中的表達情況及其臨床意義。方法：收集2016年10月—2018年6月鄭州大學第二附屬醫院收治的IBD患者48例，其中潰瘍性結腸炎(UC)患者36例，克羅恩病(CD)患者12例，以30例結腸癌旁正常組織作為對照。采用免疫組化法檢測結腸組織中CLEC4D和CARD9表達，并分析其與臨床特征的相關性。結果：UC組、CD組結腸組織中CLEC4D和CARD9表達均顯著高于對照組(P<0.05)，而UC組與CD組之間無明顯差異(P>0.05)。UC組CLEC4D、CARD9表達與Mayo評分、Baron分級呈正相關(P<0.05)，CD組CLEC4D、CARD9表達與CDAI評分呈正相關(P<0.05)，與SES-CD評分無明顯相關性(P>0.05)；IBD患者CLEC4D、CARD9表達與CRP呈正相關(P<0.05)，而與ESR無明顯相關性(P>0.05)。結論：CLEC4D、CARD9在IBD患者中的表達升高，且與患者病情密切相關，CLEC4D可能通過CARD9相關途徑參與IBD的腸道免疫。

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)包括潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC)和克羅恩病(Crohn’s disease, CD)，其是一種病因不明的慢性非特異性消化道炎癥性疾病，目前認為腸道微生物、免疫功能異常在IBD的發生、發展中起有重要作用。腸道微生態包括細菌、真菌、病毒等，目前關于細菌在IBD中的研究較多，而相關真菌的研究較少[1]?，F有研究表明無論是小鼠DSS結腸炎模型還是IBD患者，其腸道真菌數量和多態性均發生變化，表明真菌在IBD中發揮一定作用，但具體作用機制仍不清楚[2]。

C型凝集素(C-type lectins)是模式識別受體的重要組成部分，在抵御真菌感染、介導免疫炎癥過程中起有重要作用[3]。C型凝集素結構域家族4成員D(C-type lectin domain family 4 member D, CLEC4D)是最近發現的C型凝集素家族成員，可特異性識別真菌細胞壁成分α-甘露聚糖，誘導Th17細胞分化，參與抗真菌反應[4]。胱天蛋白酶募集域蛋白9(caspase recruitment domain-containing protein 9, CARD9)在真菌、分枝桿菌的先天性免疫中發揮作用。在C型凝集素介導的全身性真菌感染中，CARD9可將先天性免疫與Th17細胞分化聯系起來，起關鍵的信號轉導作用[5]。此外，CARD9的某些遺傳變異可增加真菌感染風險。

目前CLEC4D、CARD9在人體胃腸道免疫中是否起作用仍不清楚。本研究通過檢測IBD患者中CLEC4D、CARD9的表達情況，旨在探討其在IBD中的作用及其可能的機制。

材料與方法

一、一般資料

收集2016年10月—2018年6月鄭州大學第二附屬醫院門診和住院IBD患者48例，其中UC患者36例，CD患者12例。IBD的診斷符合2018年中華醫學會消化病學分會炎癥性腸病學組制定的診斷標準[6]。48例IBD患者中，男性22例，女性26例；年齡15～69歲，平均(42.3±15.8)歲，且近4個月內未接受過激素、免疫抑制劑、生物制劑治療，未合并其他自身免疫病。以同期30例行外科手術切除的結腸癌旁正常組織(距癌組織5 cm以上)作為對照，均經病理檢查證實。其中男性17例，女性13例；年齡42～76歲，平均(52.2±12.2)歲。本研究方案通過鄭州大學第二附屬醫院倫理委員會批準，入選者均簽署知情同意書，。

二、方法

1. 免疫組化法檢測結腸組織CLEC4D、CARD9表達：組織切片經脫蠟，梯度乙醇水化，抗原高壓修復，抗原封閉，滅活內源性過氧化物酶，滴加兔抗人多克隆抗體CLEC4D (美國Abcam公司，稀釋比例為1∶500)、CARD9(Cloud-Clone公司，稀釋比例為1∶500)，4 ℃冰箱孵育過夜；滴加二抗，DAB顯色；蘇木素復染，分化，封片。以PBS代替一抗作為陰性對照，已知陽性切片作為陽性對照。

結果判斷：細胞質內出現棕黃色顆粒為陽性細胞。高倍(×400)視野下，計數陽性細胞數，隨機選取5個視野，取均值。每張切片由兩名病理科醫師分別計數，雙盲下進行評分。陽性細胞百分比：0～5%，0分；6%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；>75%，4分。染色強度：無著色，0分；淺黃色，1分；棕黃色，2分；黃褐色，3分。染色總評分為陽性細胞百分比與染色強度之積，0分，陰性；1～4分，弱陽性；5～8分，陽性；9～12分，強陽性。

2. 疾病活動性、內鏡表現評估：CD患者疾病活動性評估采用Best CD活動指數，內鏡下表現評估采用SES-CD評分[7]；UC患者疾病活動性評估采用改良Mayo評分系統，內鏡下表現采用Baron量表分級系統進行評估[8]；同時收集患者初次住院時的ESR、CRP。

三、統計學分析

結 果

一、患者的一般情況

36例UC患者中，CLEC4D弱陽性表達15例，陽性15例，強陽性6例；CARD9弱陽性表達9例，陽性21例，強陽性6例。12例CD患者中，CLEC4D弱陽性表達4例，陽性2例，強陽性6例；CARD9弱陽性表達2例，陽性6例，強陽性4例。各組患者疾病活動性評分、內鏡下表現評分、ESR、CRP結果見表1。

二、各組結腸組織CLEC4D、CARD9表達情況

各組結腸組織CLEC4D、CRAD9表達情況見圖1、圖2。與對照組相比，UC、CD組CLEC4D、CARD9表達均顯著升高(P<0.05)，而UC組與CD組之間相比無明顯差異(P>0.05)(表2)。

三、CLEC4D、CARD9表達與患者臨床特征關系

UC組CLEC4D、CARD9表達與Mayo評分呈正相關(r=0.331，P<0.05；r=0.379，P<0.05)，與Baron分級亦呈正相關(r=0.330，P<0.05；r=0.334，P<0.05)；CD組患者CLEC4D、CARD9表達與CDAI評分呈正相關(r=0.588，P<0.05；r=0.636，P<0.05)，與SES-CD評分無明顯相關性(r=0.332，P>0.05；r=0.428，P>0.05)。

IBD患者CLEC4D、CARD9表達與CRP呈正相關(r=0.689，P<0.01；r=0.302，P=0.037)，而與ESR無明顯相關性(r=0.376，P=0.137；r=0.282，P=0.060)。

表2 各組CLEC4D和CARD9評分比較

*與對照組比較，P<0.05

討 論

IBD患者的腸道微生態發生了改變，其中真菌的改變主要表現為機會致病菌數量增多，主要包括念珠菌屬、毛孢子菌屬和釀酒酵母菌[9]。Jawhara等[10]的研究發現，給予DSS結腸炎小鼠白念珠菌灌胃后，腸道組織中髓過氧化物酶以及腫瘤壞死因子(TNF)-α增加，腸道炎癥反應加重。Qiu等[11]給予DSS結腸炎小鼠氟康唑治療后，體質量較對照組明顯降低，結腸明顯縮短。上述研究表明腸道真菌在IBD的發生、發展中起有重要作用，但其具體的作用機制楚尚未完全清楚。

CLEC4D、CARD9是機體抵抗真菌感染的關鍵分子。本研究結果顯示，與對照組相比，UC、CD患者結腸組織中CLEC4D、CARD9表達均明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。提示CLEC4D、CARD9可能在IBD的發生中起有作用。UC主要由Th2細胞引起，而CD主要與Th1細胞相關，兩者的發病機制存在明顯差異。目前認為Th17細胞和IL-17在IBD中起有重要的促炎作用。在系統性免疫中CLEC4D主要通過Syk-CARD9-Bcl-10通路，介導NF-κB誘導Th17細胞分化，從而發揮抗感染的作用[12]。Wang等[13]以DSS誘導CLEC4D缺陷小鼠結腸炎，結果顯示與野生型小鼠相比，其炎癥反應加重，腸道中熱帶念珠菌數量增加，Th17細胞減少，IL-17表達降低等。提示CLEC4D可能通過誘導Th17細胞分化和IL-17表達發揮作用。后續研究將檢測IBD患者結腸組織或外周血中IL-17表達，并進一步分析其與CLEC4D、CARD9的關系，從而探討CLEC4D可能的作用機制。

表1 CD和UC患者疾病活動性、內鏡下評分、ESR和CRP結果

A：對照組；B：UC組；C：CD組

A：對照組；B：UC組；C：CD組

此外，本研究還發現，UC組CLEC4D、CARD9表達與Mayo評分、Baron分級呈正相關；CD組CLEC4D、CARD9表達與CDAI評分呈正相關，但與SES-CD評分無明顯相關性。SES-CD評分系統主要根據CD患者結腸鏡結果進行評估，而CD則可發生于整個消化道，同時部分患者存在因嚴重狹窄而結腸鏡無法通過的情況，影響了SES-CD評分對CD患者總體狀況的評估。但總體而言，CLEC4D表達與IBD患者病情嚴重程度呈明顯正相關。

本研究還發現，IBD患者CLEC4D、CARD9表達與CRP呈正相關，而與ESR無明顯相關性。雖然ESR和CRP是評估炎癥程度的重要血清學指標，但既往研究發現與ESR相比，CRP能更好地反映中-重度IBD的活動性[14]，本研究中，中-重度UC、CD患者占84%，這可能是造成該結果的原因之一，同時也不能排除樣本過少導致的實驗誤差。

綜上所述，本研究發現CLEC4D、CARD9在IBD患者中的表達升高，且與患者病情嚴重程度相關，CLEC4D可能通過CARD9相關途徑參與IBD的腸道免疫，但機制仍不明確，應行進一步研究闡明其具體的作用方式。