結腸癌患者外周血γδT細胞Tim-3、PD-1`表達及其臨床意義*

李曉咪 陸慧敏 李 歌 石通國 張光波 陳衛昌&

蘇州大學附屬第一醫院消化內科1(215006)江蘇省(科教強衛)胃腸道腫瘤免疫重點實驗室2 江蘇省(高校)臨床免疫學重點實驗室3

背景：腫瘤的發生與免疫系統功能密切相關，共刺激分子異常表達與執行固有免疫功能的γδT細胞功能異常有關。T細胞免疫球蛋白和黏蛋白分子-3(Tim-3)和程序性死亡分子-1(PD-1)是重要的負性共刺激分子，與相應配體結合后可影響T淋巴細胞免疫功能，從而介導腫瘤細胞免疫逃逸。目的：初步探討結腸癌患者外周血γδT細胞表面Tim-3、PD-1表達及其臨床意義。方法：選取2017年12月—2018年6月蘇州大學附屬第一醫院44例住院結腸癌患者，采集術前外周血標本，40名健康志愿者作為對照組，以密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(PBMC)，流式細胞術檢測γδT細胞表面Tim-3、PD-1表達，分析兩者表達與結腸癌臨床病理特征的相關性。結果：結腸癌患者外周血Tim-3+、PD-1+、Tim-3+PD-1+ γδT細胞比例均顯著高于健康志愿者(P<0.05)，并與腫瘤體積和TNM分析呈顯著正相關(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤部位、有無遠處轉移則無明顯相關性(P>0.05)。結論：結腸癌患者外周血γδT細胞表面Tim-3、PD-1表達明顯升高并與腫瘤臨床病理分期相關，有可能成為評估結腸癌發生、發展的客觀指標。

結直腸癌的發生、發展是一個多因素、多階段、多種分子參與的過程，患者機體免疫狀態在其中發揮重要作用[1]。眾所周知，淋巴細胞是免疫系統的重要組分，T淋巴細胞根據T細胞受體(TCR)的組成差異，可分為αβT細胞和γδT細胞兩類。γδT細胞是一類進化上保守的非主要組織相容性復合物(MHC)限制性固有T細胞，可快速識別外源性病原體和內源性應激誘導分子，并啟動適應性免疫應答，是機體免疫防御系統第一道防線的重要組成部分。活化的γδT細胞在炎癥和腫瘤免疫應答中發揮多種效應功能，如釋放裂解酶以破壞細菌或損傷的細胞、分泌促炎細胞因子如干擾素-γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，或發揮抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)等[2]。

T細胞的活化需有兩個信號：第一信號由TCR識別抗原呈遞細胞(APC)表面的抗原肽-MHC復合物(p-MHC)啟動；第二信號由T細胞與APC間共刺激分子的相互作用啟動。共刺激分子大致可分為正性共刺激分子和負性共刺激分子兩類，后者又稱為免疫檢查點(immune checkpoint)，包括細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4(cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)、淋巴細胞活化基因-3分子(lymphocyte activation gene-3, LAG-3)、T細胞免疫球蛋白和黏蛋白分子-3(T-cell immunoglobulin mucin-3, Tim-3)、程序性死亡分子-1(programmed death-1, PD-1)、B、T淋巴細胞衰減因子(B- and T-lymphocyte attenuator, BTLA)等。國內有學者發現Tim-3和PD-1在結直腸癌患者腫瘤組織和外周血CD4+T細胞表面高表達，可能通過引起CD4+T細胞功能耗竭，介導腫瘤細胞免疫逃逸，促進結直腸癌進展[3]。Tim-3和PD-1在結腸癌患者外周血γδT細胞表面的表達情況是否與既往研究結果存在差異，目前尚未見文獻報道。本研究通過檢測結腸癌患者和健康志愿者外周血γδT細胞表面的Tim-3、PD-1表達，初步探討其表達變化在結腸癌發生、發展中的意義。

材料與方法

一、臨床資料

2017年12月—2018年6月蘇州大學附屬第一醫院普外科44例住院結腸癌患者納入研究，所有入組患者均為初診，入組前未接受過手術、放療、化療、生物治療等抗腫瘤治療，無全身性免疫系統疾病，術后病理證實為結腸癌；男性26例，女性18例，年齡37～93歲，平均(66.43±12.45)歲。另選取40名健康志愿者作為對照組，其中男性21例，女性19例，年齡30～75歲，平均(63.37±13.04)歲。病例組與對照組間性別、年齡構成差異無統計學意義(P>0.05)。研究方案經蘇州大學附屬第一醫院醫學倫理委員會審核批準實施(2018倫審批第046號)，標本采集征得受檢者知情同意并簽署知情同意書。

二、主要試劑和儀器

人外周血淋巴細胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限責任公司)；熒光抗體鼠抗人CD4-FITC、CD4-PE、CD3-PC5、CD3-PC7、γδT-FITC、IgG-PE、IgG-PC7、Tim-3-PE、PD-1-PC7(Biolegend公司)。CytomicsTMFC 500流式細胞儀(Beckman Coulter公司)。

三、方法

1. 標本采集：結腸癌患者術前使用EDTA抗凝管采集空腹外周血標本2 mL，以相同方法采集健康志愿者空腹外周血標本2 mL，標本于采集后2 h內進行檢測。

2. 密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(PBMC)：所采集的外周血標本放入無菌離心管中，以無菌PBS稀釋血液1倍，反復吹打均勻后，加入預先加有淋巴細胞分離液的離心管中(稀釋血液與分離液之比為2∶1)，1 800 r/min離心25 min；吸取中間白色的淋巴細胞白膜層，加入預裝15 mL PBS的離心管中，1 800 r/min離心5 min；棄盡PBS，以15 mL PBS重懸細胞，1 200 r/min離心5 min。獲得的細胞即為PBMC，用于后續實驗。

3. 流式細胞術檢測外周血Tim-3+、PD-1+、Tim-3+PD-1+γδT細胞比例：取7只無菌流式管，分別加入PBMC (1～2)×106個(100 μL)，并依次標記①～⑦，按相應序號分別加入以下抗體：①空白對照組；②CD4-FITC 0.5 μL；③CD4-PE 0.5 μL；④CD3-PC5 0.5 μL；⑤CD3-PC7 0.5 μL；⑥CD3-PC5 0.5 μL +γδT-FITC 1.5 μL+IgG-PE 0.2 μL+IgG-PC7 0.2 μL；⑦ CD3-PC5 0.5 μL +γδT-FITC 1.5 μL+Tim-3-PE 3 μL +PD-1-PC7 3 μL。混合均勻后置于冰上避光孵育20 min，各管加1 mL PBS洗1遍，1 200 r/min 離心5 min；棄盡PBS，以300 μL PBS重懸細胞，上流式細胞儀檢測，FlowJo流式細胞分析軟件進行數據分析。

四、統計學分析

應用SPSS 23.0統計學軟件，實驗結果數據不符合正態分布，以M(P25～P75)表示，兩組間比較采用兩獨立樣本Mann-Whitney U檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、結腸癌患者外周血Tim-3+、PD-1+、Tim-3+PD-1+ γδT細胞比例變化

流式細胞分析顯示，結腸癌患者外周血Tim-3+、PD-1+、Tim-3+PD-1+γδT細胞比例均明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)(圖1)。

二、結腸癌患者外周血Tim-3+、PD-1+、Tim-3+PD-1+ γδT細胞比例與臨床病理特征的關系

統計學分析顯示，結腸癌患者Tim-3+、PD-1+、Tim-3+PD-1+γδT細胞比例與患者性別、年齡、腫瘤部位、有無遠處轉移無明顯相關性(P>0.05)，與腫瘤體積和TNM分期呈顯著正相關，腫瘤體積越大、TNM分期越高，Tim-3+、PD-1+、Tim-3+PD-1+γδT細胞比例越高(P<0.05)(表1)。

右半結腸：盲腸、升結腸、結腸肝曲、橫結腸；左半結腸：結腸脾曲、降結腸、乙狀結腸[4]

TNM分期：根據2017 NCCN結腸癌臨床實踐指南

腫瘤體積V=ab2/2(cm3)，a(cm)為腫瘤標本最大直徑，b(cm)為腫瘤標本最小直徑[5]

圖1 結腸癌患者外周血Tim-3+、PD-1+、Tim-3+PD-1+ γδT細胞比例變化

討 論

近年來，隨著生活習慣和膳食結構的改變，在一些發展中國家，包括中國、俄羅斯、巴西等，結直腸癌發病率逐年上升[6]。結直腸癌發病機制復雜，機體免疫缺陷或免疫抑制是腫瘤發生、發展的主要原因之一[1]。γδT細胞是執行固有免疫功能的T細胞，其TCR由γ鏈和δ鏈組成，活化的γδT細胞可通過分泌細胞因子(IFN-γ、TNF-α)、釋放顆粒酶和穿孔素以及通過Fas、TRAIL死亡受體途徑發揮抗結腸癌作用[7]。目前研究表明，γδT細胞的活化和增殖需要CD28協同刺激信號，表明共刺激分子在γδT細胞的活化中起有重要作用[8]。

Gertner-Dardenne等[9]的研究發現，共刺激分子BTLA與其配體皰疹病毒入侵介質(HVEM)相互作用可負性調控γδT細胞分化和增殖，從而介導腫瘤細胞免疫逃逸。而與BTLA同為負性共刺激分子的Tim-3和PD-1在結腸癌患者外周血γδT細胞中作用的研究尚少。Tim-3是T細胞免疫球蛋白和黏蛋白結構域基因家族成員之一，PD-1為免疫球蛋白超家族成員，兩者在多種免疫細胞表面均有表達，如T細胞、樹突細胞(DCs)、單核細胞、肥大細胞、自然殺傷細胞(NK細胞)、腫瘤浸潤性淋巴細胞(TILs)，可能參與機體炎癥和應激反應，同時其表達受腫瘤微環境中多種分子的調控。兩者與相應配體結合后，T細胞出現“耗竭現象”，調節性T細胞(Treg細胞)介導的免疫抑制功能增強，促使腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophage, TAM)向M2型極化，從而形成有利于腫瘤形成的微環境，進而促使腫瘤細胞發生免疫逃逸[10-12]。

研究發現Tim-3、PD-1在多種惡性腫瘤的TILs和外周血中呈高表達，如結直腸癌、肝細胞癌、胃癌、宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌等，并與腫瘤進展和患者預后密切相關[3,10-11,13-14]；Tim-3基因多態性與包括消化系統惡性腫瘤在內的多種惡性腫瘤風險增加密切相關[15]。有學者分析了Tim-3在結腸癌組織和相應正常結腸組織中的表達情況，發現其在結腸癌組織中呈高表達，并與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期和預后不良呈顯著正相關[16]。但Zhang等[17]的研究發現，結直腸癌患者外周血和腫瘤組織中的Tim-3表達顯著下調，并與腫瘤體積和TNM分期呈負相關，腫瘤體積越大、TNM分期越高，Tim-3 mRNA和蛋白表達水平越低。盡管有關Tim-3在結直腸癌中表達和功能的報道存在不一致性，但這些研究提示Tim-3在結直腸癌的發生、發展中扮演重要角色，有待進一步深入研究。Berntsson等[18]的研究發現結直腸癌組織中PD-1表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移和遠處轉移密切相關。上述數據均提示Tim-3和PD-1與結直腸癌的發生、發展有密切聯系。然而，目前關于兩者在結腸癌患者外周血γδT細胞表面表達情況的研究尚少。本研究檢測了44例結腸癌患者和40名健康志愿者的外周血γδT細胞表面Tim-3、PD-1表達情況，發現結腸癌患者外周血Tim-3+、PD-1+、Tim-3+PD-1+γδT細胞比例均顯著高于健康志愿者，進一步分析其表達與腫瘤臨床病理特征的相關性，發現外周血Tim-3+、PD-1+、Tim-3+PD-1+γδT細胞比例與患者性別、年齡、腫瘤部位、有無遠處轉移無關，而與腫瘤體積和TNM分期顯著相關，腫瘤體積越大、TNM分期越高，即腫瘤負荷越大，外周血γδT細胞表面Tim-3、PD-1表達水平越高。推測高表達的Tim-3和PD-1與相應配體結合后，發揮對γδT細胞功能的抑制作用，使其失去免疫監視、免疫清除能力，最終導致腫瘤發生、發展和轉移。

綜上所述，結腸癌患者外周血γδT細胞表面Tim-3、PD-1表達明顯升高并與腫瘤臨床病理分期相關，有可能成為評估結腸癌發生、發展的客觀指標。本研究的不足之處在于樣本量偏小且未能對高表達的Tim-3和PD-1如何影響γδT細胞功能作進一步研究分析。后續研究擬擴大樣本量以驗證本次結果，并對Tim-3、PD-1影響γδT細胞功能的可能分子機制進行深入探討，從而更全面、充分地了解γδT細胞表面Tim-3、PD-1表達變化在結腸癌發生、發展中的作用，為結腸癌治療提供新的靶點。