SLAF-seq技術在鑒別桉樹品種中的應用

龐貞武，劉鑫，孫雪陽，蘭俊，陳德文

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SLAF-seq技術在鑒別桉樹品種中的應用

龐貞武，劉鑫，孫雪陽，蘭俊，陳德文

(廣西國有東門林場，廣西 扶綏 532108)

本文嘗試采用一種簡化基因組測序技術(SLAF-seq)對2個尾巨桉無性系品種進行分子鑒定。實驗共獲得32.69 M reads的測序數據，測序質量值分布檢查結果Q30為95.28%，堿基分布檢查結果GC含量為40.61%；通過生物信息學分析共開發SLAF標簽857 589個。樣品間SNP多態性比較結果表明，A1與A2、A3的基因型一致SNP比例分別為35.81%、77.27%，達到區分不同無性系品種的實驗設計預期。

尾巨桉；無性系；分子鑒定；SLAF-seq技術

桉樹是桃金娘科(Myrtaceae) 桉屬() 樹種，是重要的短周期工業原料林樹種，在熱帶、亞熱帶和溫帶地區廣為種植[1]，桉樹人工林給我國帶來了巨大的經濟效益、社會效益和生態效益[2]。桉樹良種無性系在我國廣西、廣東、海南等華南地區大面積推廣種植，種苗市場需求量大，提供相應種苗的苗圃和組培廠數量很多。因主要推廣種植的良種無性系如尾巨桉() DH32-29、DH32-26、DH32-28等桉樹基因來源于廣西國有東門林場，而一些沒有獲得使用授權的生產單位為謀取種苗市場利益采取魚目混珠的手段，以非良種桉樹無性系進行種苗生產，這些種苗在苗期的外觀上與用良種無性系系生產的種苗差異很小，難以分辨，導致企業維權和相關部門執法困難，進而影響了造林戶種植效益和我國造林良種率的提高。因而，探討在植物遺傳物質層面采用分子檢測手段進行桉樹無性系種苗品種鑒定具有現實的意義。目前的文獻報道也有這方面的嘗試，如周長品等[3]利用SNaPshot技術對桉樹SNP 復合分型檢測體系的研究、SILVA-JUNIOR等[4]發掘SNP位點并開發SNP 檢測芯片、劉海龍[5-6]等利用 ISSR 標記和ITS序列分析技術進行桉樹無性系鑒定、劉果等[7]利用SSR 標記進行桉樹樹種精準鑒定。SLAF-seq(Specific Locus Amplified Fragment Sequencing)技術是一項簡化基因組測序技術，該技術可以用較低的花費實現全基因組范圍的標記開發和分型，是目前最熱門的標記分型技術之一。本文嘗試探討SLAF-seq技術用于桉樹無性系種苗品種鑒定的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

無性系品種分別為尾巨桉DH32-28(東門28)、DH32-29(東門29)，實驗材料為苗期的新鮮嫩葉，取自廣西國有東門林場苗木中心苗圃。

1.2 方法

1.2.1 實驗設計

分別以A1、A2、A3標記采集的樣品作為3個處理，A1為尾巨桉東門28，A2為尾巨桉東門29，A3為尾巨桉東門28(作為對照)。在A1、A2、A3每個處理的樣品中，各從5株不同組培苗上取相同數量嫩葉，5株苗的葉片混合在一起。取樣后用錫箔紙包裹并標注，立即液氮速凍，保存于液氮中。

1.2.2 DNA提取與檢測

采用CTAB法提取DNA。DNA檢測樣量：200 ~ 500 ng； Marker為λDNA/HindIII(或其他有20 Kb以上條帶的DNA Ladder)；瓊脂糖凝膠濃度：0.8% ~ 1.0%；電泳條件：電壓3 ~ 4 V·cm-1，時間40 min。獲得的基因組DNA樣品濃度≥20 ng·ul-1，樣品總量≥2μg(不包括樣品檢測損耗)；樣品純度OD260/280為1.7 ~ 2.2。樣品送至專業機構(北京百邁客生物科技有限公司)委托采用SLAF-seq技術進行簡化基因組測序。

1.2.3 簡化基因組測序主要實驗流程

根據選定的最適酶切方案，對檢測合格的各樣品基因組DNA分別進行酶切實驗。對得到的酶切片段(SLAF標簽)進行3′端加A處理、連接Dual-index測序接頭、PCR 擴增、純化、混樣、切膠選取目的片段，文庫質檢合格后用Illumina HiSeqTM 進行測序。利用 Dual-index 對測序得到的原始數據進行識別，得到各個樣品的酶切片段(reads)。對過濾完接頭的測序 reads 進行測序質量和數據量的評估。通過reads間聚類的方法，在待測樣品中開發SLAF標簽(經過SLAF-seq建庫產生的特異酶切片段，一個酶切片段就是一個SLAF標簽)，尋找在樣品間存在多態性的SNP(單核苷酸多態)標簽。

2 結果與分析

2.1 測序數據產出和質量

本實驗樣品共獲得32.69 M reads測序數據。堿基識別(Base Calling)過程中每個堿基都會得到一個測序質量值，用于評估該堿基的準確性。測序質量值是評估高通量單堿基錯誤率的重要指標，該值越高對應的堿基測序錯誤率越低。從表1可知，測序平均Q30達95.15%。

堿基類型分布檢查用于檢測有無AT、GC 分離現象，而這種現象可能是測序或者建庫所帶來的，并且會影響后續分析。由于SLAF-seq測序reads為基因組DNA的酶切片段，其堿基分布會受到酶切位點和PCR 擴增的影響，堿基分布會呈現不同程度的波動。表1的數據表明，堿基分布檢查平均GC含量為40.07%。

表1 各樣品測序數據統計表

說明：1.Q30為測序質量值大于或等于30的堿基所占百分比；2.GC為測序結果中G和C兩種堿基所占總堿基的百分比。

2.2 SLAF 標簽統計

經過生物信息學分析，本項目共開發 857 589個SLAF 標簽，具體統計見表2。

表2 SLAF 標簽統計

2.3 SNP 檢測

SNP的檢測主要使用GATK 軟件工具包實現，以保證檢測得到的SNP的準確性并得到最終的SNP位點集。主要檢測過程首先使用GATK進行InDel Realignment，即對存在插入缺失比對結果附近的位點進行局部重新比對，校正由于插入缺失引起的比對結果錯誤；其次使用GATK和Samtools 進行變異檢測，主要包括SNP和InDel；第三根據GATK和 samtools分別得到的變異中將位點一致的部分作為最終的變異位點用于后續分析。具體流程參考GATK官方網站的Best Practice。所有樣品的SNP 統計信息見表3。

2.4 樣品間多態性SNP比較

對3個樣品間的多態 SNP 進行兩兩比較，表4為 A1 分別與A2、A3比較的差異結果。A1與A2的基因型一致的SNP比例為35.81%，A1與A3的基因型一致的SNP比例為77.27%。

表3 樣品檢測的SNP統計

表4 樣品間的SNP多態性

3 結論

本研究結果表明，A1與樣品A3 的基因型一致的SNP占兩樣品間總SNP比例為77.27%，遠高于A1與A2的基因型一致SNP 比例，因而它們是同一個品種的可能性最高，這與實驗設計A1為尾巨桉東門28、A2為尾巨桉東門29、A3為尾巨桉東門28(作為對照)的品種設置是一致的。由此可初步推測，通過應用SLAF-seq技術獲得尾巨桉不同無性系SNP分子標記的多態性差異從而進行桉樹無性系品種鑒定具有一定的可行性和可靠性，且應用該簡化測序技術測序費用較低，為相關企業和單位通過遺傳分子手段維權提供了便捷且成本相對低廉的途徑，因而值得進行更深入廣泛的應用性研究。

[1] 祁述雄.中國桉樹(第2版)[M].北京:中國林業出版社, 2002.

[2] 楊民勝,謝耀堅,劉杰鋒.中國桉樹研究三十年: 1981—2010[M].北京:中國林業出版社,2011.

[3] 周長品,翁啟杰,甘四明,等.應用SNaPshot 技術對桉樹SNP的檢測[J].南京林業大學學報(自然科學版), 2018,42(4):83-88.

[4] SILVA-JUNIOR O B,FARIA D A,GRATTAPAGLIA D. A flexible multi-species genome-wide 60K SNP chip developed from pooled resequencing of 240tree genomes across 12 species[J].New Phytologist, 2015, 206(4):1527-1540.

[5] 劉海龍,王以紅,陳博雯,等.利用ISSR標記方法鑒定5個桉樹優良無性系[J].西部林業科學,2011,40(3):66-68.

[6] 劉海龍,陳曉明,覃子海,等.ITS序列在桉樹種質資源鑒定中的應用研究[J].西部林業科學,2010,39(4):85-88.

[7] 劉果,謝耀堅,吳志華,等.SSR 標記在桉樹樹種精準鑒定中的應用分析[J].熱帶亞熱帶植物學報, 2018,26(2):116-124.

Application of SLAF-seq Technology in Identification ofVarieties

PANG Zhenwu, LIU Xin, SUN Xueyang, LAN Jun, CHENG Dewen

(,,,)

In this paper, molecular identification of twoclones was performed using a simplified genome sequencing technology: SLAF-seq. In these experiments, the sequencing data of 32.69 M reads was obtained, the sequencing quality value distribution test result Q30 was 95.28%, and the base distribution test result GC content was 40.61%. A total of 857 589 SLAF labels were developed using bioinformatics analysis. The results of the comparison of SNP polymorphisms between samples showed that the proportions of A1, A2 and A3 with the same genotype were 35.81% and 77.27% respectively, which reached the expectation of the experimental design to distinguish different clonal varieties.

; clone; molecular identification; SLAF-seq technology

S722.3+7

A

龐貞武(1981― )，男，碩士，工程師，主要從事林業種苗生產技術研究