米糠毛油酶法脫酸的工藝優化

趙晨偉，王 勇，李明祺，李 明，李 磊，金青哲

(1.江南大學 食品學院, 江蘇 無錫 214122； 2.豐益(上海)生物技術研發中心有限公司，上海 200137；3.諾維信(中國)生物技術有限公司，北京 100085)

米糠油又稱稻米油，受米糠生產企業運輸存放條件的限制，現階段國內米糠毛油酸價(KOH)普遍在20 mg/g左右，有的甚至高達40 mg/g以上[1]。

高酸價米糠毛油若采用傳統堿煉脫酸，一般每個酸價的煉耗達1.2%，精煉率低，且能耗高，排放大。同時，米糠毛油中的有益物質谷維素在堿煉過程中大部分損失，生育三烯酚也會遭到破壞，從而降低米糠油的品質[2]。采用物理精煉脫酸，煉耗能降到0.55%～0.6%，但物理精煉對毛油預處理要求非常嚴格，常規脫膠處理難以完全脫除米糠毛油中的膠質，導致物理精煉油的口感與色澤較差，還可能產生聚合物和反式脂肪酸等風險因子[3]。

酶法脫酸是近年發展起來的新型油脂脫酸方法[4-13]，是利用脂肪酶催化毛油中的游離脂肪酸與酰基受體發生酯化反應，將其轉變為酯，達到脫酸目的，同時提高油脂得率[14]。相較于傳統的化學堿煉脫酸和物理精煉脫酸方法，酶法脫酸具有油脂損耗低、成品油品質優、有益物質保留率高、能耗低、環境污染小等優點[4]。本文以米糠毛油為原料，采用固定化脂肪酶CALB進行酶法脫酸工藝優化研究，旨在尋求較優的米糠毛油精煉方法，達到多出油，出好油，提高稻米資源利用率和增值效益的目的。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

米糠毛油，秦皇島金海食品工業有限公司提供，已經脫膠處理，酸價(KOH)20.52 mg/g(游離脂肪酸含量10.26%)，甘一酯含量1.58%,甘二酯含量7.52%。固定化脂肪酶CALB，諾維信中國有限公司提供。甘油、無水乙醇、甘一酯、甘二酯等試劑均為分析純。

高速剪切機，循環水式真空泵，HH-2數顯電子恒溫水浴鍋，TG18G臺式高速離心機，BT-9300H激光粒度分布儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 米糠毛油酶法脫酸

稱取一定量米糠毛油于三口燒瓶中，用氫氧化鈉溶液調pH至6附近，加入反應所需的不同酰基受體，添加量以?；荏w與游離脂肪酸摩爾比計，并剪切混合，之后加入一定量的固定化脂肪酶 CALB在一定溫度下反應，反應過程通氮氣，并維持體系真空度小于1 000 Pa，反應一定時間后，將反應物取出，10 000 r/min離心10 min后收集上層油相測定酸價，并計算酯化率。

酯化率=(AV0-AV1)/AV0×100%

式中：AV0、AV1分別為酯化前后油脂酸價。

1.2.2 酸價的測定

酸價測定按照GB 5009.229—2016 《食品安全國家標準 食品中酸價的測定》執行。

2 結果與討論

2.1 ?；荏w對酯化率的影響

?；荏w是分子上有羥基并可與游離脂肪酸的羧基發生酯化反應的化合物[15]。?；荏w可以是內源的，也可以是外加的，米糠毛油中存在的內源的酰基受體有甘一酯、甘二酯、甾醇等。

在反應物中添加不同的?；荏w，酰基受體添加量與游離脂肪酸的摩爾比均為1∶3，之后進行剪切混合，剪切速度25 m/s，剪切時間20 min，之后加酶進行反應，反應時在反應裝置底部通入氮氣，同時抽真空，維持真空度小于1 000 Pa，反應溫度60℃，加酶量50 g/kg，反應時間6 h，測定米糠毛油的酯化率，結果見圖1。

由圖1可知，這幾種酰基受體由于所含羥基數目、空間結構、溶解度不同，酯化率差異較大，甘油的酯化率比甘二酯、甘一酯略高，這主要是由于甘油的空間位阻較小，米糠毛油中的游離脂肪酸易與甘油結合形成酯類[5]。

同時不加酰基受體的對照組的酯化率達到了55%，說明米糠毛油中存在的內源的?；荏w可以與游離脂肪酸發生反應，明顯降低米糠毛油酸價。因此，對于酸價不高的米糠毛油，可以不外加酰基受體而利用內源酰基受體達到酯化脫酸目的。相對于不加酰基受體的對照組，添加?；荏w的酯化率有明顯的提高。因此，在后續實驗中用甘油作為?；荏w。

圖1 ?；荏w對酯化率的影響

2.2 通氮氣對酯化率的影響

酶法脫酸原理是酯化反應，反應生成物是甘油酯和水。該反應是可逆反應，為了打破酯化反應平衡，使反應往酯化方向繼續進行，關鍵是將反應產生的水去除。為此在反應過程中由底部通入氮氣，同時抽真空，維持真空度小于1 000 Pa，在甘油與游離脂肪酸摩爾比1∶3，剪切速度25 m/s,剪切時間20 min，反應溫度60℃，加酶量50 g/kg條件下，反應不同時間后測定酯化率，結果見圖2。

圖2 通氮氣對酯化率的影響

由圖2可知，抽真空同時通入氮氣，可以明顯提高酯化率，這是由于氮氣一方面可以增強攪拌，促進兩種底物的接觸；另一方面氮氣在被真空抽離的同時也降低了整個體系的蒸汽分配壓，起到了蒸餾的作用，使得反應生成的水快速汽化分離，從而加速了酯化反應向右進行，提高酯化率。因此，實驗選擇抽真空同時通入氮氣，維持真空度小于1 000 Pa。

2.3 高速剪切對酯化率的影響

酯化反應時兩種底物即甘油和油脂并不互溶，需將兩種底物充分混合以增大正向反應速率。因此，需研究甘油分散粒徑對反應的影響。取米糠毛油，加入所需甘油，進行剪切混合，控制剪切速度為25 m/s，剪切時間分別為3、5、20 min。取樣品，靜置24 h后，通過激光粒度分布儀檢測甘油粒徑，分別得到甘油的分散粒徑為大于15 μm、5～15 μm、小于1 μm。分別對不同粒徑的體系在甘油與游離脂肪酸摩爾比1∶3，反應溫度60℃，加酶量50 g/kg，抽真空同時通入氮氣，維持真空度小于1 000 Pa條件下反應不同時間后測定酯化率，結果見圖3。

圖3 高速剪切對酯化率的影響

由圖3可知，甘油粒徑相同時，酯化率隨著反應時間的延長呈現上升趨勢，而隨著甘油粒徑的減小，相同反應時間內酯化率顯著提高。當甘油粒徑小于1 μm時，反應6 h，酯化率達到88%。因此，后續實驗均采用先將甘油高速剪切后再反應。剪切條件為剪切速度25 m/s，剪切時間20 min。

2.4 加酶量對酯化率的影響

在甘油與游離脂肪酸摩爾比1∶3，剪切速度25 m/s，剪切時間20 min，反應溫度60℃，反應時間6 h，抽真空同時通入氮氣，維持真空度小于1 000 Pa，添加不同量的脂肪酶，反應后測定酯化率，結果見圖4。

圖4 加酶量對酯化率的影響

由圖4可知，酯化率隨著加酶量的增加而增加，當加酶量達到50 g/kg以后，增大加酶量對酯化率的影響較小。原因是：在機械攪拌下，反應體系所形成的界面面積是一定的，只能容納有限的酶與底物在此結合，當界面面積被酶和底物飽和后，再增大加酶量，對酯化效果的影響不大；其次，加酶量過多，可能會引起酶在反應界面聚集，從而降低反應體系的有效界面面積。因此，綜合考慮酯化效率與成本，確定最適加酶量為50 g/kg。

2.5 反應時間對酯化率的影響

在甘油與游離脂肪酸摩爾比1∶3，剪切速度25 m/s，剪切時間20 min，反應溫度60℃，加酶量50 g/kg，抽真空同時通入氮氣，維持真空度小于1 000 Pa的條件下，反應不同時間后測定酯化率，結果見圖5。

圖5 反應時間對酯化率的影響

為了能夠達到合適的催化效果，延長反應時間是常用手段之一。但反應時間過長會影響酶的回收與再催化活性，影響生產效率。由圖5可知，在反應初期，酯化率隨反應時間延長而增加，當反應時間為6 h時，酯化率為82.56%。超過6 h后，酯化率沒有明顯上升。反應24 h時，酯化率為94.58%。相對于6 h的酯化率來說，反應時間延長18 h，酯化率僅升高12.02個百分點，長時間反應并未明顯提高酯化率，所以反應時間為6 h最佳。

2.6 反應溫度對酯化率的影響

在甘油與游離脂肪酸摩爾比1∶3，剪切速度25 m/s，剪切時間20 min，加酶量50 g/kg，抽真空同時通入氮氣，維持真空度小于1 000 Pa，反應6 h，不同溫度反應后測定酯化率，結果見圖6。

圖6 反應溫度對酯化率的影響

由圖6可知，酯化率隨著反應溫度升高呈先上升后降低的趨勢，這是因為隨著反應溫度上升脂肪酶的活力上升，能夠更有效地催化酯化反應，但隨著反應溫度進一步上升，脂肪酶發生熱變性，活力下降，甚至失活，從而導致酯化率下降。當反應溫度為70℃時，酶促效果達到最大水平。因此，將最適溫度確定為70℃。

2.7 甘油中水分含量對酯化率的影響

在甘油與游離脂肪酸摩爾比1∶3，剪切速度25 m/s，剪切時間20 min，反應溫度70℃，加酶量50 g/kg,反應時間6 h,抽真空同時通入氮氣，維持真空度小于1 000 Pa，甘油總量不變條件下添加不同量的水，反應后測定酯化率，結果見圖7。

圖7 甘油中水分含量對酯化率的影響

甘油在分子結構方面含有3個羥基，具有很強吸水性。而作為反應底物的甘油在反應過程中一直與酶直接接觸，純甘油會將脂肪酶發揮活性所需的水奪走，造成脂肪酶活性降低。由圖7可知，隨著甘油中水分含量增加，酯化率先增高后下降，甘油中水分含量為25%時，酯化率最高。這說明在甘油中水分含量為25%時，正好滿足脂肪酶所需活化水量，但隨著甘油中水分含量繼續增加，會使酯化反應逆向進行，導致酯化率下降。因此，最終選擇甘油中水分含量為25%。

2.8 最佳工藝條件的驗證實驗

通過上述實驗，確定最佳工藝條件為：甘油與游離脂肪酸摩爾比1∶3,剪切速度25 m/s，剪切時間20 min，加酶量50 g/kg，反應溫度70℃，反應時間6 h，甘油中水分含量25%，真空度小于1 000 Pa，通氮氣。在最佳工藝條件下，米糠毛油酸價(KOH)從20.52 mg/g降至1.54 mg/g，酯化率可達92.5%。

3 結 論

研究了固定化脂肪酶 CALB對米糠毛油的酶法脫酸工藝條件。結果表明，最佳反應條件為：甘油與游離脂肪酸摩爾比1∶3，剪切速度25 m/s，剪切時間20 min，加酶量50 g/kg，反應溫度70℃，反應時間6 h，甘油中水分含量25%，真空度小于1 000 Pa，通氮氣。在最佳工藝條件下，米糠毛油的酯化率達到92.5%。