新塔花對(duì)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型中TLR4/NF-κb信號(hào)通路的影響*

張 華 王思靜 邢 科 徐亦男 馬學(xué)寬 倪 昀 王 麗 安冬青

（新疆醫(yī)科大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830011）

心腦血管病是影響全球病死率最高的疾病，其發(fā)病率程升高趨勢(shì)，目前我國(guó)心血管病患者數(shù)約2.9億人次，而動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是缺血性心腦血管病的主要病理基礎(chǔ)［1］，有多種學(xué)說從不同的角度闡述其發(fā)病機(jī)制。近些年關(guān)于AS機(jī)制的研究取得了很大的進(jìn)步，這對(duì)于防治AS進(jìn)一步改善患者的生活質(zhì)量具有很大的意義。AS在不同的病理生理過程始終伴隨著炎癥反應(yīng)。研究表明，組織受損能夠誘導(dǎo)免疫反應(yīng)從而激活Toll樣受體 4（TLR4），介導(dǎo)下游因子，激活核因子-κb（NF-κb），啟動(dòng)一系列的炎性因子轉(zhuǎn)錄，從而引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致血管損傷，導(dǎo)致 AS的發(fā)生［2-5］。

新塔花（Ziziphora clinopodioidesLam.），又名唇香草，主要分布在我國(guó)新疆，中亞及中東等部分地區(qū)。此藥具有安神、舒張血管、降血壓、抗炎止痛等功效，主要用于治療失眠、高血壓病、冠心病等疾病［6-8］。目前關(guān)于新塔花水提物治療AS的研究尚未報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)首次從其抗炎方面防治AS進(jìn)行研究，以期為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只健康8周齡雄性，體質(zhì)量（20±2）g，載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠，同品系C57普通小鼠，購(gòu)于北京維通利華公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011。飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院科技樓動(dòng)物房，倫審編號(hào)：20171129-02。

1.2 試藥與儀器 新塔花全草，購(gòu)于新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院（鑒定人：張選明，石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科，副主任醫(yī)師）。阿托伐他汀（批號(hào)20151223，1 g/瓶，北京Solarbio公司）、HE染色試劑盒 （北京Solarbio公司）；ICAM、MMP-9 ELISA試劑盒 （上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司）；GAPDH、TLR4、p-NF-κbp65蛋白購(gòu)于Elabscience生物公司；PBS緩沖液粉末（pH7.3，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；檸檬酸鹽修復(fù)液粉末 （PH6.0，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；DAB 顯色液（invitrogen 公司，美國(guó)）；二抗（Anti-Rabbit，invitrogen公司，美國(guó)）。EG1150組織包埋機(jī)（SAKURA，日本）；RM2235 石蠟切片機(jī)（Leica公司，德國(guó)）；5424R 低溫高速離心機(jī)（Eppendrof，德國(guó)）；光學(xué)顯微鏡（LEICA DM 2500，德國(guó)）；Type1500 多功能酶標(biāo)儀（Thermo 公司，美國(guó)）等。

1.3 分組方法 將40只8周齡ApoE（-/-）小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng) 1周后，隨機(jī)分為模型組（MX）、他汀組（TT）、新塔花水提物高劑量組 （XG）、新塔花水提物低劑量組（XD），每 10只；同品系 C57小鼠 10只為空白組（KB）；高脂飼料室溫飼養(yǎng)。第 2 周開始，TT 組［3 mg/（kg·d）］，XG 組［3.6 g/（kg·d）］，XD 組［0.9 g/（kg·d）］3 組開始藥物灌胃干預(yù)，MX組和KB組灌胃等量蒸餾水。

1.4 新塔花水提物的制備 取干燥芳香新塔花全草24 g，粉碎后置于圓底燒瓶中，加入200 mL蒸餾水，加熱回流2 h后洗滌濾渣，水提率75%，置于旋蒸燒瓶?jī)?nèi)真空加熱1 h，得水提物80 mL左右，定容至100 mL即為所需新塔花高劑量（含生藥0.18 g/mL），稀釋2倍為低劑量（含生藥0.045 g/mL）。

1.5 給藥方法 小鼠實(shí)驗(yàn)用藥量換算公式為：［g/（kg·d）］=9.1×成人臨床常藥量 ［g/（kg·d）］， 每次灌胃 0.5 mL（0.1～0.3 mL/10 g）/d，每周按照體質(zhì)量調(diào)整給藥濃度。MX組和KB組給予0.5 mL蒸餾水灌胃。所有小鼠自由活動(dòng)，不限飲食飲水。高脂飼料配方：基礎(chǔ)飼料82.68%，豬油10%，豬膽鹽0.2%，膽固醇2%，蔗糖5%，丙硫氧基嘧啶0.12%，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心加工。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè) 所有小鼠灌胃12周末禁食不禁水12 h后，處死小鼠進(jìn)行以下操作：1）眼球取血后，3 500 r/min離心15 min，取上清置于Ep管內(nèi)用于ELISA和血脂檢測(cè)；2）打開胸腹腔，無(wú)菌條件下取出小鼠胸主動(dòng)脈置于4%多聚甲醛固定用于HE染色，升主動(dòng)脈和主動(dòng)脈弓置于4%多聚甲醛固定用于免疫組化。胸主動(dòng)脈與升主動(dòng)脈甲醛固定48小時(shí)，依次經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋后，進(jìn)行切片，每個(gè)組織連續(xù)切片4 μm厚度5張；按照試劑盒操作，HE染色，依次經(jīng)過觀察小鼠主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化并拍照；ELISA法依次經(jīng)加樣、溫育、配液洗滌、拍干、加酶、顯色、終止等步驟。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度（OD）值，以濃度值為橫坐標(biāo)（X），各標(biāo)準(zhǔn)OD值為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出小鼠血清中ICAM-1和 MMP-9濃度值。IHC法檢測(cè) TLR4、NF-κbp65蛋白陽(yáng)性面積表達(dá)，經(jīng)烤片、脫蠟、修復(fù)、抗體孵育、過夜、顯色、復(fù)染、封片等步驟，在光鏡下觀察主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化并拍照，運(yùn)用進(jìn)行Image J軟件進(jìn)行陽(yáng)性面積分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多組比較用單因素方差分析，兩兩比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05或P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠血脂水平比較 見表1。與KB組比較，MX 組三酰甘油（TAG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）明顯升高，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）明顯降低（P＜0.01）；與 MX 組比較，TT 組、XG組、XD組 TAG及TC降低明顯 （P＜0.01），TT組HDL-C 和 LDL-C 略升高 （P＞0.05），XG 組、XD 組HDL-C升高明顯 （P＜0.01），XG組、XD組 LDL-C均降低（P＜0.01）；與TT組比較，XG組各指標(biāo)具有明顯的差異（P＜0.01）。

表1 各組小鼠血脂水平比較（mmol/L，x±s）

表1 各組小鼠血脂水平比較（mmol/L，x±s）

與 KB組比較，*P＜0.01；與 MX 組比較，△P＜0.01；與 TT組比較，#P＜0.01。 下同

組 別 n KB組 6 MX組 6 TT組 6 LDL-C 0.36±0.06 5.84±0.94*6.04±0.19 XG 組 6 0.85±0.15△# 9.81±0.08△#0.99±0.07△#3.86±0.33△#XD 組 6 1.06±0.18△ 10.07±0.96△ 0.9±0.15△ 4.3±0.37△TAG TC HDL-C 0.64±0.01 2.75±0.04 2.17±0.1 1.34±0.07* 15.32±1.01* 0.62±0.01*0.97±0.08△ 13.53±2.86△ 0.63±0.08

2.2 各組小鼠胸主動(dòng)脈病理形態(tài)學(xué)變化 胸主動(dòng)脈HE染色中，KB組管壁幾乎無(wú)脂質(zhì)沉積，管腔無(wú)明顯狹窄。MX組血管壁明顯增厚，出現(xiàn)大量的脂質(zhì)沉積和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，管腔狹窄明顯；XG組動(dòng)脈粥樣斑塊面積明顯小于MX組，大于KB組；XD組血管壁增厚，內(nèi)部脂質(zhì)沉淀和斑塊略低于MX組，管腔有狹窄。TT他汀組管腔狹窄不明顯，斑塊面積小于MX組，血管損傷小，脂質(zhì)沉積較少。見圖1。

圖1 小鼠胸主動(dòng)脈病理形態(tài)學(xué)變化（HE染色，200倍）

2.3 各組小鼠血清中ICAM-1和MMP-9表達(dá)水平比較 見表2。與KB組比較，MX組ICAM-1和MMP-9水平升高（P＜0.01）；與 MX 組比較，TT 組、XG 組、XD組ICAM-1和MMP-9水平均明顯低于MX組 （P＜0.01）；XG組與TT組比較，ICAM-1水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），MMP-9水平差異明顯有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表2 各組小鼠血清ICAM-1和MMP-9表達(dá)水平比較（x±s）

表2 各組小鼠血清ICAM-1和MMP-9表達(dá)水平比較（x±s）

組 別 n KB組 6 MX組 6 TT組 6 ICAM-1 MMP-9 435.35±9.73 63.31±0.54 581.54±15.26* 87.65±1.55*423.90±2.47△ 70.01±1.57△XG 組 6 416.57±22.06△ 56.06±1.42△#XD 組 6 475.87±3.18△ 70.85±0.07△

2.3 各組小鼠升主動(dòng)脈中TLR4、NF-κb免疫組化結(jié)果比較 見表3。研究結(jié)果表明，與KB組比較，模型組中TLR4和NF-κb積分光密度值上升（P＜0.01）；與MX組比較，TT組、XG組TLR4積分光密度值均下降（P＜0.01），XD 組無(wú)明顯差異（P＞0.05）；與 MX 組比較，TT組、XG 組、XD 組 NF-κb積分光密度值均下降（P＜0.01）。與TT組比較，XG組TLR4積分光密度值無(wú)差異（P＞0.05），XG 組 NF-κb積分光密度值較低（P＜0.05）。

表3 各組小鼠升主動(dòng)脈組織中TLR4和NF-κb的平均光密度定量分析比較（x±s）

表3 各組小鼠升主動(dòng)脈組織中TLR4和NF-κb的平均光密度定量分析比較（x±s）

組 別 n KB組 6 MX組 6 TT組 6 TLR4 NF-κb 7.36±0.40 4.67±0.24 13.74±1.31* 9.53±0.78*9.77±0.80△ 7.79±0.25△XG 組 6 9.81±0.51△ 6.49±0.33△#XD 組 6 13.31±1.15*△ 7.76±0.51△

3 討 論

新塔花全草中的化學(xué)成分主要為揮發(fā)油和非揮發(fā)油（總黃酮等）兩部分。新塔花揮發(fā)油為透明淡黃色油狀液體，約占全草的2%［9］。國(guó)外有學(xué)者采用GC和GC-MS法對(duì)伊朗地區(qū)新塔花進(jìn)行化學(xué)分析，得出新塔花揮發(fā)油中發(fā)現(xiàn)27種成分，主要的化合物包括胡薄荷酮（44.5%）等［10］。大量研究表明新塔花具有抗心肌缺血、抗炎殺菌、舒張血管、抗氧化等作用，近些年受到廣泛的關(guān)注和研究［11-17］。

本研究觀察新塔花對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠TLR4/NF-κb信號(hào)通路的影響，結(jié)果顯示，各藥物干預(yù)組TLR4、NF-κb的表達(dá)水平明顯低于模型對(duì)照組，表明新塔花可能通過降低TLR4/NF-κb信號(hào)通路內(nèi)的蛋白表達(dá)水平，降低細(xì)胞間黏附因子、基質(zhì)金屬蛋白酶產(chǎn)生，最終抑制炎癥反應(yīng)，起到防治AS的效果。研究結(jié)果還顯示新塔花高劑量組比低劑量組藥效明顯，說明該藥具有一定的劑量依賴性。

該實(shí)驗(yàn)對(duì)新塔花的研究為進(jìn)一步拓展新塔花資源，發(fā)揮中醫(yī)藥多靶點(diǎn)、多層面和個(gè)體化的優(yōu)勢(shì)，尤其是應(yīng)用于防治以AS為基礎(chǔ)的心腦血管疾病，具有重要指導(dǎo)意義，為新塔花在心血管病研究中提供了科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。但是，新塔花哪些成分起到了靶向作用，有待深入的研究。如果并不是所有生物堿都能以抑制信號(hào)通路、抗炎為靶向防治心腦血管疾病，筆者推斷新塔花揮發(fā)油可能會(huì)是抗炎的主要成分，其藥效學(xué)和機(jī)制有待進(jìn)一步研究。