逆電針少陽經特定穴對偏頭痛大鼠50%縮足閾值及血清中CGRP、SP含量的影響*

劉秋佳 葉意紅 王乾娜 劉未艾△ 陳建宏 賀新民

（1.湖南中醫藥大學第二中醫臨床學院，湖南 長沙 410005；2.湖南中醫藥大學附屬衡陽醫院，湖南 衡陽 421000）

“逆針灸”是指在無病或將病未病之時，預先應用電針方法激發經絡之氣，以增強抗病能力的針灸方法，屬于中醫治未病范疇。明·高武《針灸聚英》提出“無病而先針灸曰逆，逆，未至而迎之也”。欲病救萌，防微杜漸，“逆電針”即循用逆針灸配合電針的方法。

偏頭痛是一種反復發作的頭痛疾患，呈一側或雙側疼痛，常伴有惡心、嘔吐，少數病例發作前可伴有視覺、感覺先兆，致殘率高，疾病負擔重。《全球疾病負擔（GBD）研究報告》顯示，偏頭痛的全球患病率高達14.7%，是世界三大常見疾病之一，且高居世界致殘性疾病第6位［1-2］。目前臨床上的治療手段如西藥或外科手術可取得一定的療效，但不良反應較多［3］。針刺具有良好的即時鎮痛和遠期效應，在防治偏頭痛中不可或缺；近年來，國內外的多中心、大樣本的臨床隨機對照試驗證實，針刺防治偏頭痛發作療效確切［4-5］。研究表明，偏頭痛發作時患者外周血中降鈣素基因相關肽（CGRP）、P物質（SP）等神經遞質的水平會發生不同的變化，而且這些變化可能與偏頭痛的發生、持續等有關［6-7］。本課題組在前期研究中發現電針少陽經特定穴可以有效改善偏頭痛癥狀及頭痛程度［8-10］。然而，逆電針治療是否可以有效預防偏頭痛的發生或緩解急性偏頭痛發作時的疼痛程度，目前尚未見相關報道。本研究通過觀察逆電針少陽經特定穴對偏頭痛模型大鼠的50%PWT及血清中CGRP、SP含量的影響，探討預防性給予電針少陽經特定穴對改善偏頭痛程度和促進偏頭痛癥狀恢復的作用及其可能機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SPF級SD大鼠60只，體質量200～250 g，雌雄各半，月齡 3～4 月，購于湖南中醫藥大學動物實驗中心，許可證編號：SCXK（湘）2013-0005。飼養溫度20～25℃，濕度50%～70%，適應性喂養3 d后進行實驗。

1.2 藥劑與儀器 硝酸甘油注射液（規格5 mg/mL，批號國藥準字H20057216，河南潤弘制藥有限公司）；降鈣素基因相關肽（CGRP）試劑盒（生產批號201708，武漢華美生物工程有限公司）；P物質（SP）試劑盒（生產批號201708，武漢華美生物工程有限公司）；臺式高速冷凍離心機（貨號H1650R，湖南湘儀儀器有限公司）；全自動酶標洗板機（貨號PW-812，深圳匯松科技發展有限公司）；多功能酶標分析儀（貨號MB-530，深圳匯松科技發展有限公司）；恒溫培養箱（貨號DHP-500，北京市永光明醫療儀器有限公司）；自動平衡離心機（貨號L530，湖南湘儀儀器有限公司）；華佗牌電針儀（型號SDZ-Ⅱ，蘇州醫療用品廠有限公司）；華佗牌針灸針（φ0.25×13 mm，生產批號 160230，蘇州醫療用品有限公司）；Von Frey針刺痛覺測試儀套件（型號Aesthesio，深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；37450-045大型多孔金屬平臺測試架（規格90 cm×38 cm×40 cm，底部網孔5 mm×5 mm，深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；多配置動物圍欄（型號37000-006，深圳市瑞沃德生命科技有限公司）。

1.3 分組與造模 按隨機數字表法將60只大鼠隨機分為空白組（n=20）、模型組（n=20）、逆電針組（n=20），其中每組又分為造模后30 min組、造模后90 min組，每組各10只。空白組、模型組正常飼養并同電針組同時段捆綁30 min×7 d，逆電針組正常飼養并捆綁行電針治療30 min×7 d。空白組第8天皮下注射等量0.9%氯化鈉注射液，模型組、逆電針組第8天皮下注射硝酸甘油造模，實驗動物處置均符合科技部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》要求。空白組臀部皮下注射0.9%氯化鈉注射液10 mg/kg，其余組參照TASSORELL C等方法按10 mg/kg臀部皮下注射硝酸甘油注射劑造模［11］。模型評價：造模約10 min后，大鼠出現雙耳發紅、撓頭、爬籠次數增多、咬尾等活動增加表現，出現以上現象為造模成功。50%PWT評價：使用Von Frey針刺痛覺測試儀［12］，記錄引起大鼠四肢縮足反應顯示的刺激力，推算50%PWT，以判斷偏頭痛大鼠的疼痛程度。每組大鼠造模前后對比，如果造模后50%PWT較造模前明顯降低，則說明大鼠造模后痛閾降低，對疼痛更敏感，造模成功。電針治療方法：在捆綁下，參照新世紀全國高等中醫院校規劃教材《實驗針灸學》及華興邦的大鼠穴位圖譜［13］，以華佗牌0.25 mm×13 mm一次性無菌針灸針分別刺入大鼠的雙側“風池”“外關”“陽陵泉”穴，進針1～6 mm之間，行平補平瀉手法，捻轉角度為180°，頻率為120次/min；持續捻轉0.5～2 min，行針結束后，電針少陽經特定穴組選取“外關”“陽陵泉”穴，同側兩針柄分別連接電針儀導線的正負極，采用疏密波進行刺激，強度0.5～1.0 mA，頻率10/50 Hz，每次 30 min。

1.4 標本采集與檢測 1）血液樣品的收集與處理：50%PWT測定結束后，以20%烏拉坦4 mL/kg腹腔內注射麻醉，予腹主動脈采血，常溫放置2～3 h，4℃3 000 r/min，離心15 min，取上清液，-20℃保存待測。2）行為學評分：通過觀察并記錄偏頭痛模型大鼠的行為癥狀進行評分，包括撓頭、爬籠、往返、咬尾等，出現1次計1分。治療前0～30 min第1次評分（治療前），造模后0～30 min第2次評分，造模后30～60 min第3次評分，造模后60～90 min第4次評分，造模后90～120 min第5次評分。3）50%PWT測定：參照Chapland等方法，將大鼠置于穿孔金屬平臺上，以標準動物圍欄分籠隔開，使后足底充分暴露［14］。使用Von Frey針刺痛覺測試儀，刺激大鼠同側后爪趾面的中間區域，觀察其后肢縮足反射，記錄引起大鼠縮足反應的刺激力及陽性陰性反應序列，通過 Up and Down 法［dixon 法］［12］推算 50%PWT。4）血清中CGRP、SP的測定：采用酶聯免疫法（ELISA）檢測大鼠血清中CGRP、SP的含量。

1.5 統計學處理 應用SPSS22.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，所有數據都進行正態性和方差齊性檢驗。滿足正態性時，兩組計量資料采用兩獨立樣本t檢驗（Two-sample t-test），多組計量資料采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間比較若方差齊時采用LSD檢驗，方差不齊時用Dunnett T3法檢驗；不滿足正態性時選擇秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠行為學評分比較 見表1。治療前，兩組大鼠行為學評分差異無統計學意義（P＞0.05）。造模后，與空白組對比，模型組行為學評分明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；且與治療前對比，模型組造模后行為學評分明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01），提示造模成功。模型組造模后各組對比，從造模后30～120 min行為學評分呈遞減趨勢，其中造模后0～30 min與造模后30～60 min對比、造模后60～90 min與造模后90～120 min對比差異均無統計學意義（P＞0.05），其余各組對比均有顯著差異（P＜0.01），提示大鼠具有一定的自愈性，且模型組大鼠0～60 min處于較活躍狀態，60 min后大鼠趨于安靜，分別以造模后30 min及造模后90 min 2個時間點大鼠行為學評分較穩定。

表1 各組大鼠行為學比較（分，x±s）

表1 各組大鼠行為學比較（分，x±s）

與空白組同時間比較，**P＜0.01；與本組造模后0～30 min比較，##P＜0.01；與本組造模后 30～60 min 比較，△△P＜0.01

治療前 造模后 0～30 min 5.20±1.03 5.70±0.95 5.80±1.14 34.8±2.53**組 別 n 造模后30～60 min造模后60～90 min 造模后90～120 min空白組 10 5.1±1.45 5.50±1.08 5.4±0.84模型組 10 33.70±2.50** 27.2±3.08**##△△ 26.90±3.87**##△△

2.2 各組大鼠50%PWT比較 見表2。治療前，各組大鼠50%PWT差異無統計學意義（P＞0.05）。造模后，與空白組對比，模型組、逆電針組50%PWT均降低（P＜0.01），提示造模成功；與模型組對比，逆電針組50%PWT均升高（P＜0.01），提示預防性治療有效。與造模后30 min對比，模型組50%PWT造模后90 min升高，差異有統計學意義（P＜0.05），提示大鼠具有一定的自愈性；逆電針組50%PWT造模后90 min升高，差異有統計學意義（P＜0.05），提示逆電針治療可以緩解大鼠偏頭痛程度，尤以造模后90 min最為顯著。

表 2 各組大鼠 50%PWT比較（g，x±s）

表 2 各組大鼠 50%PWT比較（g，x±s）

與空白組同時間比較，**P＜0.01；與模型組同時間比較，##P＜0.01；與本組造模后30 min比較，△P＜0.05

組 別 n 造模后30 min n造模后90 min空白組 20 6.35±1.41 10 6.64±1.04治療前 n 6.46±1.36 10模型組 20 2.59±0.67** 10 3.18±0.49**△6.35±0.65 10逆電針組 20 6.58±0.86 10 3.60±0.52**## 10 4.22±0.61**##△

2.3 各組大鼠血清中CGRP、SP含量比較 見表3。與空白組比較，模型組CGRP、SP含量升高，差異有統計學意義（P＜0.01），說明造模后大鼠 CGRP、SP 含量是升高的。與模型組比較，逆電針組CGRP、SP含量呈下降趨勢，差異有統計學意義（P＜0.01），尤其在造模后90 min顯著降低。與造模后30 min對比，模型組CGRP、SP含量略有下降，但差異無統計學意義 （P＞0.05）；逆電針組CGRP、SP含量下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表3 各組大鼠不同時間點血清中CGRP、SP含量比較（ng/L，x±s）

表3 各組大鼠不同時間點血清中CGRP、SP含量比較（ng/L，x±s）

與空白組同時間比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組同時間比較，##P＜0.01；與本組造模后 30 min比較，△P＜0.05

組別 時間 CGRP SP空白組 造模后 30 min 13.48±0.89 54.84±3.38（n=10） 造模后 90 min 13.57±0.90 55.08±0.59模型組 造模后 30 min 19.34±1.25** 66.72±4.03**（n=10） 造模后 90 min 19.24±1.33** 65.92±2.35**逆電針組 造模后30 min 16.37±1.26**## 60.67±3.70**##（n=10） 造模后 90 min 14.74±0.94*##△ 57.30±2.04*##△

3 討 論

頭痛與六經密切相關，《冷廬醫話·頭痛》曰“屬少陽者，上至兩角，痛在頭角”，而偏頭痛好發在側頭部，為少陽經循行區域，與手足少陽經密切相關，故治療的關鍵在于通利少陽經脈氣血，針刺取穴時應以少陽經為主。

在偏頭痛的發病機制中，三叉神經血管源性學說是目前解釋偏頭痛的主流學說，該學說認為偏頭痛與三叉神經系統的激活有關。當三叉神經末梢受到有害刺激后，釋放神經遞質如CGRP、SP等，血管擴張、通透性增加，血漿蛋白等滲出、誘發肥大細胞釋放組胺等物質引起神經源性炎癥，最終導致頭痛的發生［15］。神經肽，主要是降鈣素基因相關肽、P物質的釋放及神經源性炎癥，被認為是偏頭痛發生的病理生理學基礎［16］。CGRP是一種舒血管神經肽，主要由三叉神經傳入纖維產生，具有強烈的擴張血管的作用，是目前公認的偏頭痛神經生物學標志物［17］。有研究表明偏頭痛發作與三叉神經血管系統的CGRP含量變化有關［18］。SP是第一級傷害性傳入纖維末梢釋放的神經遞質，其直接作用于組織，可有效傳遞痛覺，引起疼痛［19］。在偏頭痛發作初始，神經末梢大量釋放SP，血中濃度升高［20］。

通過本實驗，我們發現模型組大鼠50%PWT明顯降低，行為學評分及CGRP、SP含量均顯著高于空白組，與現有結果一致［21-22］。造模后，模型組各組對比，從造模后30～120 min行為學評分大致呈遞減趨勢，提示大鼠具有一定的自愈性，且分別以造模后30 min及造模后90 min兩個時間點行為學評分較為穩定；造模后，逆電針組50%PWT明顯高于模型組，提示電針少陽經穴預防性治療有效，可以一定程度上降低造模后大鼠偏頭痛的疼痛程度，其作用機制可能為減少三叉神經末梢對CGRP、SP等神經遞質的釋放，從而抑制三叉神經血管系統的激活，減輕疼痛程度。與造模后30 min對比，模型組造模后90 min行為學評分明顯下降，50%PWT有所升高，CGRP、SP無明顯差異，提示大鼠具有一定的疼痛緩解能力，但短時間內不能有效調節血中神經遞質的濃度；逆電針組造模后90 min 50%PWT較造模后30 min亦升高，且CGRP、SP含量均低于造模后30 min，提示逆電針少陽經特定穴減輕大鼠偏頭痛不依賴于大鼠自愈能力，其可有效調節CGRP、SP的表達，抑制神經源性炎癥，從而緩解疼痛。

綜上，逆電針少陽經特定穴可以下調血清中CGRP、SP的表達，減輕大鼠偏頭痛，可能是通過減少三叉神經末梢對CGRP、SP等神經遞質的釋放，抑制三叉神經血管系統的激活，預防性治療偏頭痛。