烏蘇里擬的人工繁殖技術(shù)總結(jié)

趙道全，李先明， 謝國強(qiáng)，武慧慧，陳軍平，邵嘉棋，劉方磊，張瑩瑩，張鳳枝

（1.河南省水產(chǎn)科學(xué)研究院，鄭州450044；2.河南師范大學(xué)，河南新鄉(xiāng)453007）

烏蘇里擬鲿（Pseudobagrus ussuriensis），隸屬于硬骨魚綱、鯰形目、鲿科、擬鲿屬。特種中型經(jīng)濟(jì)魚類，習(xí)底棲性，生活于水流緩慢的河道中。該魚野生環(huán)境中主要以底棲動物為食，3年可性成熟，體長20 cm左右，產(chǎn)卵期在6月中至7月末，懷卵量較少。是該科魚類中生長速度最快的種類，最大個體長度可達(dá)1 m。其脂肪含量高，肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，具有很高的食用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1 親魚培育

1.1 池塘條件

親魚培育池塘位于鄭州市惠濟(jì)區(qū)黃河灘區(qū)東部，水泥板護(hù)坡，沙泥塘底，地下水水源，進(jìn)排水方便，池塘面積2334㎡，水深保持在1.5～2.0 m。

1.2 親魚放養(yǎng)

共放養(yǎng)烏蘇里擬鲿300 kg，2940尾，放養(yǎng)親本各項(xiàng)指標(biāo)如表1。

表1 放養(yǎng)擬鲿親本情況表

1.3 親魚馴養(yǎng)

馴養(yǎng)親魚用黃顙魚專用飼料，漂浮性飼料，飼料臺下設(shè)置2 m×2 m PVC管方框，飼料灑于方框之中，每天早上、傍晚各喂一次，將魚馴化到水面搶食，每次掌握量以魚不強(qiáng)烈搶食為止。

1.4 親魚的選擇

親魚雌魚挑選出腹部膨大，仰腹可見卵巢輪廓（生殖突較短），生殖孔擴(kuò)張（寬而圓），手摸魚腹部松軟且富有彈性，體表無傷，體重100 g以上的個體；雄魚腹部不膨大、尾柄細(xì)長，生殖突尖而細(xì)長，生殖孔閉鎖，精巢呈鋸齒狀[1]，不易擠出精液，體質(zhì)健壯，體表無傷，體重在250 g以上的雄性親魚。

2 親魚催產(chǎn)劑的注射

親魚的催產(chǎn)是人工繁殖的重要環(huán)節(jié)。催產(chǎn)的水溫一般在20℃以上（最好穩(wěn)定在22～24℃范圍內(nèi)）時，對親魚進(jìn)行催產(chǎn)[2-3]。采取胸腔兩次注射，進(jìn)針深度1 cm左右。注射分兩次進(jìn)行，第一針下午17∶00～18∶00，劑量為每千克雌親魚注射LRH-A215～20 ug+HCG 10 IU，雄魚減半；針距12 h，第二天早5∶00～6∶00打第二針，劑量為LRH-A215 ug+HCG 800IU，雄魚減半。水溫20～24℃時，效應(yīng)時間為24 h左右。注射完畢之后需要給予親魚流水刺激，池中保持微流水，流量在10～30 m3/h，以便更好催產(chǎn)成功，注水期間應(yīng)時常注意水不能溢出池子。池中溶解氧保持大于5.5 mg/L。保持環(huán)境安靜，避光。

3 人工授精

由于擬鲿親魚發(fā)情行為不明顯，在催產(chǎn)24 h左右以后，開始人工授精，對成熟好的雌魚捕出擠卵（卵為橘黃色，卵徑平均2.0 mm）進(jìn)行半干法人工授精。擠卵時應(yīng)注意不能把池水帶入盆中，以免影響受精率。用提前保存好的精子適量灑在擠出的卵中，用硬雞毛不停的攪拌，使精卵更好地結(jié)合受精。

精子保存液研制是擬鲿人工繁殖規(guī)模化關(guān)鍵，我們進(jìn)行了深入研究，取得突破性進(jìn)展。

3.1 材料和方法

試劑：吖啶橙（AO）染液、鹽酸、Hanks精子保存液（商品購買）、hnscz精子保存液（自配優(yōu)選）。

樣本：取精子研磨，分別取Hnscz和Hanks精子保存液各8 min，顯微鏡觀察后稀釋精液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時間段，提前按4 h、96 h、144 h稀釋好后分別用試管標(biāo)號放置于4℃冰箱冷藏保存待用[4-6]。

分別取Hnscz和Hanks保存的4 h、96 h、144 h精子各30 uL；加鹽酸吸液80 uL（反應(yīng)30 s）；加AO染色液100 uL（反應(yīng)3 min）；上機(jī)（貝克曼Cyto FLEX流式細(xì)胞儀）檢測[7]。

人工授精實(shí)驗(yàn)分別取不同保存時間的精子與人工催產(chǎn)后擠出的烏蘇里擬鲿卵授精，把受精卵分別按標(biāo)號放入孵化框，在孵化槽中孵化5h統(tǒng)計(jì)受精率。

3.2 結(jié)果與分析

3.2.1 Hnscz保存的精子上機(jī)測試結(jié)果如下圖

圖1 自制精子保存液保存精子上機(jī)測試圖

3.2.2 Hanks保存的精子測試結(jié)果如下圖

圖2 Hanks精子保存液保存精子上機(jī)測試圖

3.3 實(shí)驗(yàn)分析

3.3.1 斷裂指數(shù)分析

在FSC/SSC圖上圈出精子細(xì)胞，在FL1(FITC)/FL3(ECD)散點(diǎn)圖上進(jìn)行分析。DNA完整性好的精子主要發(fā)綠色熒光(P2門)；DNA完整性差的精子主要發(fā)紅色熒光(P4門)。通過公式計(jì)算DNA斷裂指數(shù)at來評價(jià)精子DNA質(zhì)量，斷裂指數(shù)越小，精子質(zhì)量越高。αt=red/(red+green)[7]。

從實(shí)驗(yàn)測試圖形和數(shù)據(jù)得出以下結(jié)果：

Hnscz:

at1=6.37÷(39.03+6.37)=0.14

at2=11.28÷(40.65+11.28)=0.21

at3=9.48÷(23.23+9.48)=0.29

Hanks:

at1=9.44÷(32.10+9.44)=0.23

at2=8.29÷(17.18+8.29)=0.32

at3=18.85÷(38.54+18.85)=0.32

從以上斷裂指數(shù)結(jié)果來看，我們配置的Hnscz精子保存液保存的精子比購買的Hanks精子保存液保存的精子的斷裂指數(shù)小：Hnscz at1＜ Hanks at1；Hnscz at2＜Hanks at2；Hnscz at3＜ Hanks at3。說明自己研制的精子保存液Hnscz優(yōu)于商業(yè)購買的Hanks精子保存液。

3.3.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證分析

表2 二種精子保存液實(shí)用效果對照

人工授精實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Hnscz保存的精子144 h受精率81.4%，保持較高水平，與流式細(xì)胞儀測試的DNA斷裂指數(shù)Hnscz at3=0.29較低水平的結(jié)果相吻合；而Hanks保存的精子144 h受精率11.5%，已達(dá)到很低水平，不適宜在實(shí)際人工繁殖使用，與流式細(xì)胞儀測試的DNA斷裂指數(shù)Hanks at3=0.32較高水平的結(jié)果一致。

3.3.3 鏡檢觀察

顯微鏡觀察[8-9]，Hnscz保存液保存的精子6 d精子活力還旺盛，7 d活力開始減弱，9 d死亡；Hanks保存液保存的精子1 d、2 d活力較強(qiáng)，4 d活力減弱，5 d死亡。

3.4 結(jié)論

3.4.1 SCSA(斷裂指數(shù)分析)判定精子質(zhì)量好壞快速準(zhǔn)確，并能量化分析，是人工保存精子使用前檢測精子活力強(qiáng)弱的重要手段。

3.4.2 烏蘇里擬鲿精子保存液Hnscz經(jīng)SCSA分析和實(shí)際應(yīng)用檢驗(yàn)，在4℃冰箱中可以人工保存一周時間并保持精子活力旺盛，是實(shí)現(xiàn)規(guī)模化繁殖的保證。

3.4.3 對于烏蘇里擬鲿人工保存的精子來說，根據(jù)參考資料和測試實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析認(rèn)為，DNA斷裂指數(shù)at≤0.15則精子活力旺盛，保存的精子可以作為人工授精的精子來源。DNA斷裂指數(shù)at≥0.3則精子趨于衰竭，不再作為人工授精的精液來源。

4 孵化與出苗

4.1 孵化

受精卵孵化框中孵化，每4個孵化框放在一個孵化槽中，每個框放受精卵1萬粒，孵化槽采用微流水、充氣方式，每天徹底換水1次。孵化水溫保持在20℃以上，最好在22～24℃之間，孵化期間保持微流水狀態(tài)，溶解氧在6.0 mg/L以上，而在出水口一端，應(yīng)不斷給過濾網(wǎng)進(jìn)行刷洗，以免阻塞。在孵化到35 h左右時，應(yīng)給網(wǎng)片消毒一次，采用福爾馬林溶液浸泡約60 s左右，取出放入新的孵化池中，防止霉菌發(fā)生；同時要避免陽光直射。在孵化水溫20～24℃時，從受精到出膜時間為60～70 h，孵化積溫均在60～68℃·d范圍內(nèi)。

4.2 出苗

當(dāng)仔魚全部孵出后，剛孵化出膜的仔魚聚集在孵化框的四個角落，全長僅為6.0 mm左右，形似蝌蚪，卵黃囊碩大并以其為營養(yǎng)，體質(zhì)弱嫩，不能自由游泳；繼續(xù)暫養(yǎng)5～7 d后，仔魚全長可達(dá)1.0 cm,卵黃囊大大縮小，仔魚開始開口攝食，此時可進(jìn)行魚苗培育，但暫養(yǎng)時，要求水質(zhì)清潔、溶氧充分，還要避免陽光直射。

表3 繁殖實(shí)驗(yàn)獲苗數(shù)量表

從我們繁殖5批次獲苗數(shù)量看，繁殖技術(shù)在不斷提高、成熟。

5 魚苗培育

魚苗培育主要是將水花培育成2.5～3.5 cm的夏花魚苗，可選擇在水泥池和池塘中進(jìn)行，本文以池塘培育作介紹。

5.1 池塘消毒

選擇水質(zhì)良好水源充足無污染的魚池，面積1500～2000 m2，消毒須選擇晴天進(jìn)行，放養(yǎng)前6～8 d，用生石灰50～75 kg/667㎡或漂白粉7～10 kg/667㎡溶解化漿后全池潑灑。魚塘消毒5 d后將水加至60～70 cm，施基肥150～200 kg/667㎡腐熟的牛糞，以培肥水質(zhì)，增加水中生物餌料[10-11]。

5.2 放養(yǎng)密度

池塘投放密度5～6萬尾/667 m2的水花，投放一定數(shù)量的鰱、鳙魚夏花或魚種，鰱、鳙比例為3：1，以調(diào)節(jié)水質(zhì)。

5.3 投喂

采用肥水（浮游動物大量繁殖）下塘與人工投喂飼料相結(jié)合的飼養(yǎng)技術(shù)。魚苗下塘后以人工培養(yǎng)的浮游動物為食，約可維持5 d左右，從第5 d開始進(jìn)行人工投喂，在以后的5 d內(nèi)靠岸邊潑灑豆?jié){，每日4次，每次25 kg/667 m2左右；而在達(dá)第10 d時可以開始潑灑豆?jié){與粉料的混合料，每日4次，每次30 kg/667 m2左右，每桶中加入一碗粉料混勻即可；在喂養(yǎng)達(dá)15 d時可完全潑灑粉料，每日4次。同時還需要根據(jù)天氣變化，魚苗的攝食情況靈活調(diào)整投喂量；而在投喂時可適當(dāng)?shù)募尤胛⑸镏苿┤绻夂霞?xì)菌等作為飼料添加劑，一方面可防止水體惡化，同時也可以增強(qiáng)魚體抗病率。加強(qiáng)培育期間的水質(zhì)管理，定期加注新水[13-14]。

5.4 分池

經(jīng)過20 d左右的培育之后，可長成2.5～3.5 cm的夏花苗，成活率在95%左右。停食拉網(wǎng)鍛煉后分池進(jìn)行下一階段的飼養(yǎng)，避免密度過大影響生長。此魚具有集群性和避光性，在培育池中可栽種一定量的水草充當(dāng)遮蔽物。

6 小結(jié)

烏蘇里擬鲿人工繁殖取得成功，催產(chǎn)率達(dá)96%，受精率最高達(dá)98.2%，平均達(dá)93%，孵化率達(dá)75%，經(jīng)過5批次試驗(yàn)，繁殖技術(shù)逐漸成熟，繁殖水花魚苗30萬尾；自主創(chuàng)新研制了擬鲿專用精子保存液，并建立了基于SCSA精子保存液使用效果的評價(jià)體系。