寄生壯骨顆粒對木瓜蛋白酶誘導大鼠骨關節炎的作用研究

洪 鐵 *，何麗明 ，劉 放 ，郭 敏

(1.吉林省中醫藥科學院，長春130012；2.吉林大學藥學院藥理教研室，長春130021；3.吉林農業大學中藥材學院，長春130118）

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是人類中最常見的關節炎形式，一種關節整體的退行性疾病。其特征主要在于對關節軟骨、軟骨下骨、韌帶、關節囊、滑膜和關節周圍肌肉的影響。因其病因及作用機制不清楚，早期診斷和治療均存在問題，需要進一步深入研究[1]。寄生壯骨顆粒是吉林省中醫藥科學院骨科專家以傳統中醫藥理論為指導，在長期臨床實踐中總結出的經驗方。全方由桑寄生、威靈仙、獨活、秦艽、白芷、防風、赤芍、延胡索等多味中藥組成。寄生壯骨顆粒在多年臨床治療骨關節炎疾病方面取得了較好的療效。本研究探討了寄生壯骨顆粒對木瓜蛋白酶誘導大鼠骨關節炎的影響，以期為寄生壯骨顆粒治療骨關節炎提供理論依據。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

SPF級Wistar大鼠，雄性，50只，體質量210～250 g，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供，許可證號：SCXK（遼）2015-0001，將動物于動物室適應性飼養一周，溫度為20～25℃，濕度為60%～70%，12h明暗交替照明，給予維持飼料，自由飲水。

1.2 實驗試劑

木瓜蛋白酶、L-半胱氨酸由北京索萊寶科技有限公司生產；鹽酸氨基葡萄糖膠囊由北京康必得藥業有限公司生產；大鼠白介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒、大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒、大鼠白細胞介素-6(IL-6)ELISA試劑盒由上海酶聯生物科技有限公司提供；大鼠基質金屬蛋白酶-3（MMP-3）、基質金屬蛋白酶-13（MMP-13）ELISA試劑盒由武漢默沙克生物科技有限公司提供；糖胺聚糖試劑盒由上海通蔚科技有限公司生產。

1.3 實驗儀器

全波長酶標儀，Biotek公司；手持式高速勻漿機，上海巴玖實業有限公司；BS124S電子天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司；3-18k低溫高速冷凍離心機，Sigma公司；XPX-9052 MBE數顯不銹鋼電熱培養箱，上海博迅實業有限公司。

2 方法

2.1 分組給藥與動物模型的建立

將50只Wistar雄性大鼠，隨機分成6組，模型組10只，其它各組每組8只，分籠飼養。分別為正常對照組，模型組（10%木瓜蛋白酶+0.03mol/L L-半胱氨酸），鹽酸氨基葡萄糖陽性藥對照組0.13g/kg，寄生壯骨顆粒高劑量組8.69g/kg生藥、中劑量組4.35g/kg生藥、低劑量組2.12g/kg生藥。

將10%木瓜蛋白酶與0.03 mol/L的L-半胱氨酸按1∶1混合靜置30 min后備用。在實驗第0、3、6天，模型組，陽性藥對照組，寄生壯骨顆粒高劑量組、中劑量組、低劑量組給藥組大鼠膝關節腔注入0.2 mL混合溶液誘導骨關節炎模型[2]。正常對照組注射等體積生理鹽水。在末次注射木瓜蛋白酶混合溶液后，分別給予給藥組灌胃陽性藥及三個濃度的受試藥物，模型組、正常對照組灌服等體積的生理鹽水，每天一次，共計4周。

2.2 觀測指標

2.2.1 大鼠一般情況

觀察各組大鼠精神狀態、毛發、進食量及活躍狀態程度。

2.2.2 大鼠體重變化及雙膝關節寬度

觀察并記錄大鼠實驗周期的體重變化。測量造模前、給藥前，以及給藥第 1、2、3、4周的踝關節寬度，取3次測量的平均值，按照以下公式計算出關節腫脹度。

關節腫脹度(mm)=致炎后（給藥后）踝關節寬度-致炎前踝關節寬度

2.2.3 血清中 IL-6、IL-1β、TNF-α 的含量測定

大鼠麻醉后腹主動脈取血，血液至少靜置45min，4℃，3500r/min， 離心 15min， 分離血清分裝-80℃凍存。采用ELISA試劑盒測量血清IL-6、IL-1β、TNF-α的水平。

2.2.4 血清中MMP-3、MMP-13的含量測定

采用ELISA試劑盒測量血清MMP-3、MMP-13的水平。

2.2.5 滑膜組織中糖胺多糖含量測定

取稱量好的滑膜組織，加入冰生理鹽水，置于冰浴中用組織勻漿器制成2%滑膜組織勻漿，在4℃下，3500 r/min，離心10 min。取上清液，采用二甲基亞甲藍分光光度法測定糖胺多糖的含量。

2.3 統計學處理

全部實驗數據均采用SPSS17.0軟件進行，根據檢驗數據資料的正態性和方差齊性，各組數據均用±s表示，組間比較采用t檢驗比較差異的顯著性。

3 結果

3.1 大鼠一般情況

實驗開始前，各組實驗大鼠膝關節活動度正常，局部無腫脹，皮毛光滑，靈敏度佳，精神狀態及飲食、飲水能為正常。

造模過程中未出現大鼠死亡。造模結束后的大鼠除正常對照組行動正常，其余各組表現精神不振，膝關節稍有跛行。治療4周后正常對照組大鼠膝關節活動正常，飲食、飲水正常，毛色光亮，反應靈敏；模型組的大鼠均出現膝關節局部腫脹，少動，飲食、飲水減少，反應遲純等。其它給藥組大鼠膝關節腫脹度，活動情況，飲食、飲水量，反應敏捷性均有不同程度的減輕。

3.2 大鼠體重變化、雙膝關節寬度的結果

各組大鼠造模后第1周內體重增長緩慢，第2周體重開始恢復，第3周至第4周實驗結束體重開始逐漸增長。所有造模動物在實驗初期起始體重與正常對照組比較，差異無統計學意義(P＞0.05)，實驗第2周開始，與正常對照組相比，模型組體重顯著降低 (P＜0.05)，與模型組相比，各給藥組大鼠體重明顯升高，結果見表1。

實驗結果表明,正常對照組實驗前后膝關節直徑無變化。與正常對照組相比，模型組大鼠膝關節直徑顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，陽性藥對照組、寄生壯骨顆粒高劑量組的膝關節直徑顯著降低 （P＜0.01），寄生壯骨顆粒中、低劑量組的膝關節直徑明顯降低（P＜0.05），結果見表 2。

表1 寄生壯骨顆粒對大鼠體重的結果 （±s）

表1 寄生壯骨顆粒對大鼠體重的結果 （±s）

注：與正常對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

表2 寄生壯骨顆粒對大鼠膝關節腫脹度的結果（±s）

表2 寄生壯骨顆粒對大鼠膝關節腫脹度的結果（±s）

注：與正常對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

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3.3 血清中 IL-6、IL-1β、TNF-α 的結果

與正常對照組相比，模型組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α 含量顯著升高（P﹠0.01）；與模型組相比，陽性藥對照組、寄生壯骨顆粒高劑量組的IL-6、IL-1β、TNF-α含量顯著降低（P﹠0.01），寄生壯骨顆粒中、低劑量組的 IL-6、IL-1β、TNF-α 含量明顯降低 （P﹠0.05）。結果見表3。

表3 寄生壯骨顆粒對大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α含量結果

3.4 血清中MMP-3、MMP-13的結果

與正常對照組相比，模型組大鼠血清中MMP-3、MMP-13含量顯著升高（P﹠0.01）；與模型組相比，陽性藥對照組、寄生壯骨顆粒高劑量組的MMP-3、MMP-13含量顯著降低（P﹠0.01），寄生壯骨顆粒中、低劑量組的 MMP-3、MMP-13含量明顯降低 （P﹠0.05），結果見表 4。

表4 寄生壯骨顆粒對大鼠血清中MMP-3、MMP-13含量結果

3.5 滑膜組織中糖胺多糖含量測定

與正常對照組相比，模型組大鼠滑膜組織糖胺多糖含量顯著降低（P﹠0.01）；與模型組相比，陽性藥對照組、寄生壯骨顆粒高劑量組的糖胺多糖含量顯著升高（P﹠0.01），寄生壯骨顆粒中、低劑量組的糖胺多糖含量明顯升高（P﹠0.05），結果見表5。

表5 寄生壯骨顆粒對大鼠滑膜組織糖胺多糖的結果

4 討論

骨性關節炎好發于膝關節、脊柱及手指關節等部位，是以關節軟骨退變和骨質增生為基本特征的慢性進行性骨關節疾病。隨著全球老齡化的加劇，骨性關節炎已成為加重經濟負擔、影響人們生活質量的社會性問題[3]。

TNF-α在骨性關節炎的基本病理過程中起著直接促進軟骨基質降解及軟骨細胞的破壞的作用，同時TNF-α誘導生成IL-6、IL-1β的炎癥因子能加重關節滑膜的炎癥反應。本研究中我們發現模型組TNF-α、IL-6、IL-1β的含量均升高；與模型組相比，寄生壯骨顆粒治療后，TNF-α、IL-6、IL-1β 均有所下降，其中以寄生壯骨顆粒高劑量組治療效果最為明顯。

在骨性關節炎病變過程中，關節軟骨的損害首先是軟骨細胞外基質中膠原的破壞，且以Ⅱ型膠原為主，在關節軟骨退變嚴重的區域，以膠原酶和基質溶解素等為代表的MMPs類的活性最高[4]，其中MMP-3、MMP-13在骨性關節炎的疾病中表達增高。本文研究表明寄生壯骨顆粒治療組使MMP-3、MMP-13表達量顯著降低。

軟骨中蛋白聚糖的合成不足是軟骨退變的主要表現之一，而糖胺多糖是蛋白聚糖的最主要成分[5]。實驗結果顯示寄生壯骨顆粒能顯著提高組織中糖胺多糖的含量。

綜上所述，寄生壯骨顆粒在減輕木瓜蛋白酶誘導大鼠骨關節炎的同時，降低TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-3、MMP-13的表達，提高糖胺多糖含量。提示寄生壯骨顆粒治療木瓜蛋白酶誘導大鼠骨關節炎可能是從下調促炎因子的表達、抑制金屬蛋白酶產生、增加糖胺多糖的含量來治療骨關節炎。關于寄生壯骨顆粒在減輕木瓜蛋白酶誘導大鼠骨關節炎的機制有待進一步深入研究。