河車壯兒膏改善實驗小鼠免疫功能的藥效學研究*

李正宇 喻雄華# 諶章和

1 湖北省仙桃市中醫醫院 湖北 仙桃 433000

2 湖北中醫藥大學 湖北 武漢 430065

氣陰兩虛體質的小兒在日常診療中是比較常見的，小兒常因體虛或病后調養不當而造成反復呼吸道感染，影響其健康成長。河車壯兒膏是我院針對氣陰兩虛患兒進行調養的驗方，由紫河車、當歸、黃芪等28味中藥組成。為弄清該藥的治病機理，實驗小組針對氣陰兩虛小兒抵抗力差、易患呼吸道反復感染特點，進行了以下河車壯兒膏的藥效學系列實驗。

1 實驗材料

1.1 藥物:河車壯兒膏，300ml/瓶，鄂藥制字Z20180598，仙桃市中醫醫院制劑室生產，批號:20180303；黃芪顆粒，8g/袋，國藥準字Z20153620，湖北諾得勝制藥有限公司，批號:20180712。

1.2 試劑:環磷酰胺(CTX)200mg/支，江西九州制藥廠，批號:2010102；肝素鈉1250萬U/支，武漢生化制藥有限公司，批號20170309；0.9%NaCl，科倫藥業有限公司，批號:20170102；姬姆薩染液，Sigma，自配；CRBC懸液，按文獻方法配制[1]；豚鼠血清，0.3克/支:中國藥品生物制品檢定研究院，批號20171024；2，4-二硝基氯苯，Aldrich Chemical Co．Ltd；脫毛劑，廣東寶潔公司，失效期2019年4月；甲醇、丙醇均為分析純。

1.3 動物:雄性小鼠（Balb/c），8周齡，共120只。由武漢大學動物實驗中心提供，合格證號:SYXK（鄂）2014-0013，層流架內飼養。

1.4 儀器設備:Olympus顯微鏡；臺式離心機，Tcl-16G；紫外分光光度計 LNG721；37°恒溫箱 NAPCO5410；METTLER TOLEDO電子分析天平AL204型；Sartorius；打孔器，KW-trio97AO。

2 河車壯兒膏對小鼠巨噬細胞吞噬功能的作用

2.1 分組:雄性小鼠（Balb/c），8周齡，40只，隨機分為正常組、CTX組、黃芪顆粒組、河車壯兒膏組4組，每組10只。

2.2 給藥:小鼠給藥劑量以人與實驗動物之間藥物劑量公式換算其中D為藥物劑量，W為體重，K為常數。取人用量的20倍作為實驗小鼠的用藥劑量。正常組和CTX組以純凈水灌胃，劑量0.5ml/次；黃芪顆粒組以黃芪顆粒水溶物灌胃，劑量20mg/g·d；河車壯兒膏以樣品灌胃，劑量0.32ml/g·d，每日2次，共14天。

2.3 制造模型:從第10天起，CTX組、黃芪顆粒組和河車壯兒膏組皮下注射CTX 40mg/kg·d，每日1次，共3天。

2.4 實驗方法:給藥第14天后，分別按0.4ml/只劑量腹腔注射5%雞紅細胞懸液（CRBC）溶液，8h后處死小鼠，剪開腹部，用0.9%生理鹽水沖洗后吸出，離心5min。將細胞懸液混勻后，將滴到玻片上，3min后以1∶1丙酮甲醇液固定5min，姬姆薩染液染色，晾干后置顯微鏡下觀察，計數巨噬細胞，每片計200，計算吞噬指標。

2.5 結果:河車壯兒膏組和黃芪顆粒組小鼠的腹腔巨噬細胞對CRBC的吞噬指標均高于CTX組（P＜0.01），說明實驗樣品和對照品黃芪顆粒均有促進CTX組小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的效果；河車壯兒膏與黃芪顆粒比較未見顯著性差異（P＞0.05），結果見表1。巨噬細胞吞噬雞紅細胞形態學結果見圖1。

表1 壯兒膏對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響（±s）

表1 壯兒膏對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響（±s）

注:與CTX組比較，*P＜0.05 ，**P＜0.01。

0.199±0.039*0.136±0.045 0.226±0.066**0.220±0.080**37.4±5.93*25.2±11.85 46.3±7.65**43.4±16.92**CTX組黃芪顆粒組10 10

圖1 巨噬細胞吞噬雞紅細胞形態學

3 河車壯兒膏對2，4-二硝基氯苯（DNCB）引起的小鼠遲發性超敏反應的影響

3.1 方法:分組、給藥、制造模型同上。在首次給藥后第4天，各組小鼠用脫毛劑脫毛后，滴丙溶液致敏（5.0%，DNCB 20μl/只）。給藥第14天后，在小鼠左耳涂抹2.5%DNCB丙酮溶液，涂藥劑量為20μl/只，致小鼠遲發性過敏。24h后處死，用打孔器在左右對稱部位打出耳片，直徑約8mm，稱重，以左右耳片重量差表示過敏反應的強度。

3.2 結果:河車壯兒膏組和黃芪顆粒組小鼠的取片重量與CTX組比較有顯著性差異（P＜0.01），提示河車壯兒膏和黃芪顆粒對CTX引起免疫功能降低小鼠對DNCB所致遲發性超敏反應有增強作用；河車壯兒膏與黃芪顆粒比較無統計學差異（P＞0.05）。見表2。

表2 河車壯兒膏對DNCB丙酮溶液所致小鼠的遲發性超敏反應的作用（±s，mg）

表2 河車壯兒膏對DNCB丙酮溶液所致小鼠的遲發性超敏反應的作用（±s，mg）

注:與CTX組比較，**P＜0.01。

10 CTX黃芪顆粒組17.28±1.**12.79±3.92 17.24±3.43**18.48±3.20**

4 河車壯兒膏對雞紅細胞致敏小鼠溶血素抗體生成的作用

4.1 方法:分組、給藥、制造模型同上。從給藥后的第4天起，各組小鼠按0.4ml/只劑量腹腔注射5%雞紅細胞懸液。所有實驗組給藥后第14天，從眼球取血，置于管中，室溫下放置1h后離心（2000r/min），10min后取血清，用0.9Nacl稀釋100倍后取lml，與5%雞紅細胞懸液0.5ml、豚鼠血清0.5ml混合，37℃置保溫30min后，再置于0℃冰箱30min，取出離心后取上清液，用分光光度計比色，選擇波長540nm。另用0.9%NaCl做空白對照，取上清液作為比色基準。以光密度值為指標計量血清溶血素。

4.2 結果:壯兒膏組和黃芪顆粒組小鼠的血清溶血素含量高于CTX組（P＜0.01），表明河車壯兒膏和黃芪顆粒對CTX引起免疫功能下降小鼠溶血素抗體產生有較明顯促進作用；河車壯兒膏與黃芪顆粒間無顯著性差異（P＞0.05）。見表3。

表3 壯兒膏對雞紅細胞致敏小鼠血清溶血素抗體產生的作用（±s）

表3 壯兒膏對雞紅細胞致敏小鼠血清溶血素抗體產生的作用（±s）

注:與CTX組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

A 0.25±0.06*0.20±0.03 0.28±0.05**0.30±0.07**CTX組黃芪顆粒組10 10

5 結語

現代醫學的研究表明，兒童反復呼吸道感染與其免疫功能的降低有非常顯著的相關性。河車壯兒膏從培育小兒正氣的角度出發來增強小兒對疾病的抵抗力，這與現代醫學所闡明的呼吸道反復感染與小兒免疫功能的關系是一致的。本研究結果顯示，河車壯兒膏能促進CTX引起免疫功能降低小鼠的巨噬細胞吞噬功能的作用；能增強CTX引起免疫功能降低小鼠的遲發性超敏反應；能促進CTX引起免疫功能下降的小鼠溶血素抗體生成。以上實驗從藥效學的角度證實了河車壯兒膏具有益氣養陰的功效，可用于調理氣血兩虛證小兒呼吸道反復感染病癥。