空通氣孔同源框2過表達對人腺癌A549細胞增殖及轉移的影響

王 斌,張 遜

(1.天津醫科大學第四中心臨床學院 300140;2.天津胸科醫院 300095)

空通氣孔同源框2(empty spiracles homeobox 2,EMX2)是人類與果蠅ems(empty spiracles)的同源結構域基因,含同源轉錄因子[1]。EMX2作為抑癌基因在結直腸癌中低表達，與腫瘤患者遠處轉移及預后不良有密切關系[2]。目前研究已經證實，腺癌A549細胞與肺癌的增殖和轉移密切相關[3]。因此,在本研究以腺癌A549細胞系為研究對象,利用慢病毒轉染技術,使腺癌細胞系中EMX2基因過表達，觀察其對A549細胞的增殖及浸潤影響,為臨床治療非小細胞肺癌提供一種新的途徑。

1 材料與方法

1．1材料 腺癌A549細胞株購自美國模式培養物集存庫(American type culture collection,ATCC)，四甲基偶氮唑藍(MTT)購自北京鼎國生物技術有限責任公司，EMX2過表達慢病毒載體由北京合生基因科技有限公司合成并構建。

1.2方法

1.2.1慢病毒轉染 過表達慢病毒載體購自北京合生基因科技有限公司，轉染過程嚴格按照說明書進行。

1.2.2熒光定量聚合酶鏈反應(PCR) 嚴格按照試劑盒說明書操作。β-actin：上游引物5′-ACC ACA GCT GAG AGG GAA ATC G-3′，下游引物5′-AGA GGT CTT TAC GGA TGT CAA CG-3′；EMX2：上游引物5′-GTC CCA GCT TTT AAG GCT AGA-3′，下游引物5′-CTT TTG CCT TTT GAA TTT CGT TC-3′。反應條件:95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 5 s、72 ℃ 30 s，共30個循環。每個樣重復3次。

1.2.3Western blot檢測 處理細胞，進行蛋白提取，定量后十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳、轉膜、免疫印記，最后化學顯影、定影。結果分析以目標條帶IOD值與β-actin IOD值的比作為蛋白質的相對表達水平。每個實驗重復3次,取平均值。

1.2.4細胞增殖能力檢測 將對數生長期的細胞常規消化、重懸，將細胞懸液接種至96孔板中，在96孔板中分別處理3組細胞，干擾組和對照組均設置 6 個平行孔；24 h后取出其中一塊96孔板，小心移除培養基，在待檢測的樣品中加入5 mg/mL MTT液體,于 4 h 之后終止細胞培養；移除各孔內的上清液，在孔內分別加入二甲基亞砜150 μL,將96孔板置于電動搖床上低速振蕩10 min，使結晶充分溶解; 使用酶聯免疫法檢測波長490 nm 處各孔的光密度(OD)值，實驗重復3次，繪制生長曲線。

1.2.5Transwell檢測細胞侵襲能力 取對數生長期的A549 細胞培養處理24 h，收集細胞并調整細胞濃度至2×105個/mL；將無血清培養基稀釋好的Matrigel膠80 μL 加入到Transwell小室，37 ℃平衡過夜；下室中加入含20% FBS的1640培養基500 μL，上室中加入150 μL制備好的細胞懸液，在37 ℃ 5%CO2孵育24 h后,取出小室,用棉簽擦去上室的細胞,4%多聚甲酸固定15 min,PBS洗滌1次,結晶紫染色10 min,PBS洗滌1次;高倍顯微鏡下選取并計數上、下、左、右、中5個視野,計算穿過小孔的細胞數，取平均數，每組實驗重復3次。

2 結 果

2.1熒光定量PCR檢測EMX2 mRNA表達 轉染后24 h，干擾組、未干擾組及陰性對照組的EMX2 mRNA表達量分別為10.47±0.21、0.75±0.12、1.02±0.09。干擾組A549細胞中EMX2 mRNA表達明顯上調(P<0.05)，其余兩組EMX2 mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2Western blot檢測EMX2蛋白表達 干擾組、未干擾組及陰性對照組的EMX2 蛋白表達分別為0.97±0.13、0.24±0.11和0.32±0.09。經過慢病毒轉染的A549細胞EMX2的蛋白表達明顯上調(F=127.67，P=0.000)，未干擾組和陰性對照組差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1。

圖1 Western blot檢測EMX2 蛋白在各組中的表達量

2.3過表達 EMX2對A549細胞增殖的影響 轉染24 h，3組細胞OD值差異無統計學意義(F=0.306,P=0.595)。轉染后48 h開始,干擾組A549細胞的OD值明顯低于未干擾組和陰性對照組(P<0.05)，未干擾組和陰性對照組差異無統計學意義(P>0.05)。轉染后48 h，干擾組A549細胞的增殖受到明顯抑制，其余兩組未受到抑制，見圖2。轉染后24 h,干擾組A549細胞抑制率維持在一個較低水平上，48 h抑制率明顯上升達到39.66%，72 h達到新高度52.31%，見圖3。

圖2 不同時間各組的OD值

圖3 干擾組不同時間抑制率

2.4過表達EMX2對A549細胞遷移能力的影響 干擾組、未干擾組及陰性對照組的A549細胞遷移數分別為19.23±3.89、47.24±4.11、43.57±2.09，干擾組細胞侵襲數明顯低于陰性對照組和未干擾組(F=68.57，P=0.000)，陰性對照組和未干擾組差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討 論

肺癌是全球廣泛存在的最常見的一種癌癥，是導致與癌癥相關死亡的直接原因[4]。非小細胞肺癌占肺癌病理類型的80%，已經成為威脅人類健康的主要疾病[5]。盡管肺癌治療方法取得了巨大進步，但其5年生存率僅有16%，在5年內估計有35%～50%的早期非小細胞肺癌患者死亡[6]。而EMX2屬于同源盒基因(HOX)，是一種多基因家族的轉錄調節基因[7]，通過與DNA結合激活或抑制目的基因[8]。在腫瘤的發生、發展中可以通過調節胚胎的發育和分化、細胞增殖和分化發揮重要的作用[9-11]。LI等[12]研究發現,EMX2是一種腫瘤抑制基因,在胃癌腫瘤組織中其蛋白表達明顯降低,體內外實驗發現上調EMX2表達能夠抑制腫瘤細胞的增殖及轉移。OKAMOTO等[13]的研究表明,肺腺癌患者EMX2表達下調。EMX2 mRNA低表達與肺腺癌患者總生存率和無復發生存率下降明顯相關[14]。ZHANG等[15]發現,過表達EMX2能夠明顯抑制結直腸癌細胞的增殖和侵襲能力。

本研究采用慢病毒轉染技術使EMX2在肺癌 A549 細胞中出現過表達，細胞的增殖和侵襲能力研究結果顯示，經過慢病毒轉染處理的A549細胞EMX2 mRNA和蛋白表達明顯上調，而未干擾組和陰性對照組差異無統計學意義(P>0.05)。干擾組細胞增殖能力明顯下降(P<0.05)，而未干擾組和陰性對照組差異無統計學意義(P>0.05)。干擾組細胞侵襲數明顯低于陰性對照組和未干擾組(P<0.05)，其余兩組差異無統計學意義(P>0.05)。說明過表達EMX2能夠明顯抑制肺癌A549細胞的遷移，減少惡性腫瘤細胞轉移，提高生存率，這可能成為治療非小細胞肺癌的一個新的靶點。但本研究存在一定的局限性，其只在細胞系中得到了驗證，體外環境和機體內部生理環境不完全一致，后續研究將在動物體內研究EMX2基因在成瘤實驗中的作用，探討EMX2抑癌的具體機制、分子基礎、調控靶點，為將來臨床肺癌的診斷、治療提供依據。