不同提取工藝對(duì)老芽菜多糖得率的影響

翟立公， 王俊穎， 楊劍婷， 孫永康

(安徽科技學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100)

老芽菜屬龍膽科，具有清熱利膽、退黃、除濕等功效，主要分布于西南地區(qū)。多糖是由糖苷鍵結(jié)合的糖鏈，可用(C6H10O5)n通式表示[1]。多糖不是純粹的化學(xué)物質(zhì)，而是一種至少需要10個(gè)單糖組成的高分子碳水化合物，存在自然界生物中，按其來(lái)源不同，分為真菌多糖、動(dòng)物多糖、植物多糖、藻類多糖、細(xì)菌多糖5大類[2]。生物體內(nèi)的多糖主要表現(xiàn)為貯能和支持結(jié)構(gòu)的作用，而且具有細(xì)胞和細(xì)胞、病毒、抗體等互相識(shí)別的能力。自然界中存在的多糖的分子主鏈通常由D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-木糖、及L-阿拉伯糖等單糖組成。而且多糖的羥基能被氨基、甲基或巰基等基團(tuán)所取代，多糖一般不溶于水，經(jīng)水解后可得到單糖；無(wú)甜味，不能形成結(jié)晶，無(wú)還原性和變旋現(xiàn)象。

多糖具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗腫瘤的作用，不僅能激活免疫細(xì)胞[3]，還能促進(jìn)細(xì)胞因子生成[4]。多糖具有降血糖、調(diào)節(jié)血脂的作用，例如果膠等有助于降低血漿與肝組織膽固醇含量，對(duì)調(diào)節(jié)脂蛋白代謝具有明顯效果[5-6]。多糖類對(duì)細(xì)菌、病毒、真菌呈細(xì)胞毒害作用，具有抗炎和抗病毒作用[7]。同時(shí)，多糖還表現(xiàn)出抗生育和抗過(guò)氧化效果，并且對(duì)某些遺傳毒物造成的遺傳損傷及艾滋病等具有較好的抗性[8-9]。

在提取多糖的方法中，浸提法是用液體溶劑浸泡固體樣品以提取其中溶質(zhì)的方法，水可作為溶劑，是因?yàn)樗┩钢参锝M織的能力強(qiáng)，使植物細(xì)胞吸水漲破發(fā)生質(zhì)壁分離，從而液泡中的物質(zhì)溶解，提高提取效率，在生產(chǎn)上使用。酸堿提法：酸堿溶液使植物細(xì)胞因?yàn)楦邼B透壓而吸水脹破，溶解游離出來(lái)的植物多糖，提高得率。有些多糖適合用稀酸溶液提取，比如：海篙子多糖、茜草多糖，有些多糖在堿液中有更高的提取率，比如含糖醛酸多糖。生物酶提取法：酶技術(shù)是一項(xiàng)有效提取多糖的生物技術(shù)，選擇合適的酶，能分解細(xì)胞壁，加速多糖的釋放與提取，提高提取率。超聲波提取法：利用超聲波這種高頻率的機(jī)械波輔助溶劑進(jìn)行提取的方法，超聲波作用于細(xì)胞，破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，釋放有效成分，提高提取率[10]。本試驗(yàn)采用熱水水提法和超聲波提取法分別提取老芽菜中的多糖，對(duì)溫度、時(shí)間、功率、料液比和次數(shù)等進(jìn)行優(yōu)化，并且比較兩種方法提取老芽菜多糖的得率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

老芽菜(市售)；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、95%乙醇、無(wú)水乙醇、蒽酮、濃硫酸、乙醚等均為化學(xué)純，均購(gòu)于國(guó)藥試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)儀器

722型分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)；SC-02低速大容量離心機(jī)(上海中科科學(xué)儀器有限公司)；DTD-6超聲波清洗器(鼎泰生物科技有限公司)；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋(北京創(chuàng)維儀器儀表有限公司)；RT-02A微型植物粉碎機(jī)(榮聰精密科技有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 多糖提取流程及操作要點(diǎn) 將老芽菜洗凈、晾干，用粉碎機(jī)將老芽菜粉碎，經(jīng)多次粉碎收集得粗粉。根據(jù)料液比加入水，通過(guò)水浴加熱或超聲波提取將老芽菜多糖及其他成分提取出來(lái)，經(jīng)過(guò)初級(jí)醇沉，得到粗多糖，再經(jīng)二次醇沉等，除去雜質(zhì)得到多糖[11]。

1.3.2 老芽菜多糖測(cè)定 采用蒽酮-濃硫酸法測(cè)定。多糖得率=多糖質(zhì)量/粗粉質(zhì)量×100%[12-13]。

1.3.3 老芽菜多糖熱水提取法 (1)熱水浸提工藝的單因素試驗(yàn)稱取5.0 g干燥并粉碎好的老芽菜，根據(jù)熱水提取多糖的主要影響因素，分別選取溫度(50、60、70、80、90、100 ℃)、浸提時(shí)間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h)、料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)和浸提次數(shù)(1、2、3、4、5次)，提取后離心得到上清液，再經(jīng)初級(jí)醇沉、二級(jí)醇沉等獲得多糖，測(cè)定多糖提取率。

(2)熱水浸提工藝的正交試驗(yàn)對(duì)提取老芽菜多糖的影響因素[14]，時(shí)間(A)、溫度(B)、料液比(C)和次數(shù)(D)進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)。各因素水平見(jiàn)表1。

表1 熱水提取正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.4 老芽菜多糖超聲波提取法 超聲波作為一種機(jī)械波對(duì)老芽菜進(jìn)行處理，時(shí)間、功率、料液比和次數(shù)是超聲波提取多糖的主要影響因素[15-16]。針對(duì)這幾個(gè)因素，分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，測(cè)量多糖提取率。

(1)超聲波提取工藝單因素試驗(yàn)稱取5.0 g干燥并粉碎好的老芽菜，根據(jù)超聲提取多糖的主要影響因素，分別選取超聲時(shí)間(10、20、30、40、50 min)、超聲功率(48、60、72、84、96 W)、料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30)、超聲次數(shù)(1、2、3、4次)等條件提取，離心得到上清液，上清液經(jīng)初級(jí)醇沉、二級(jí)醇沉等獲得多糖，測(cè)定多糖得率。

(2)超聲波提取工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)提取老芽菜多糖的影響因素，時(shí)間(A)、功率(B)、料液比(C)、次數(shù)(D)進(jìn)行 L9(34)正交試驗(yàn)。各因素水平見(jiàn)下表2。

表2 超聲波提取正交試驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葡萄糖含量(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)可以用最小二乘法計(jì)算。總糖濃度(C，mg/mL)與吸光度(A620)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A620=1.005 7C+0.021 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.994 1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 老芽菜多糖熱水提取工藝研究結(jié)果

2.2.1 熱水提取老芽菜多糖的單因素試驗(yàn)結(jié)果 熱水提取老芽菜多糖時(shí)，不同條件處理后，獲得的多糖得率如圖2所示。由圖2A所示，在80 ℃之前多糖得率隨溫度增加而增加，當(dāng)浸提溫度為80 ℃時(shí)，多糖得率最大。由圖2B所示，在1 h之前，多糖得率明顯增加；而1 h之后時(shí)，多糖得率有下降趨勢(shì)，而且浸提時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，確定最佳的提取時(shí)間為1 h。由圖2C所示，多糖得率隨著料液比增加而不斷增大，考慮成本，最終選擇料液比為1∶20。由圖2D可見(jiàn)，當(dāng)浸提次數(shù)超過(guò)3次以上，多糖得率沒(méi)有明顯提高，同時(shí)浸提次數(shù)過(guò)多，將造成操作頻繁；因此，確定多糖的浸提次數(shù)為3次。

圖2 不同條件對(duì)老芽菜多糖熱水浸提得率的影響

2.2.2 熱水提取老芽菜多糖的正交試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)時(shí)間(A)、溫度(B)、料液比(C)和次數(shù)(D)進(jìn)行正交試驗(yàn)分析，設(shè)定正交表 L9(34)。試驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)處理見(jiàn)表3。對(duì)老芽菜多糖熱水浸提法的影響條件分別是浸提溫度>料液比>浸提次數(shù)>浸提時(shí)間，最佳工作條件為A2、B3、C3、D3，即浸提溫度70 ℃、浸提時(shí)間1.5 h、料液比1∶20、浸提次數(shù)3 次。通過(guò)方差分析所得，老芽菜多糖熱水浸提過(guò)程中，浸提溫度影響最為顯著。

表3 熱水浸提的正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 熱水浸提的正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

2.3 老芽菜多糖超聲提取工藝研究結(jié)果

2.3.1 超聲提取老芽菜多糖的單因素試驗(yàn)結(jié)果 超聲提取老芽菜多糖時(shí)，不同條件處理后，獲得的多糖得率如圖3所示。由圖3A可知，超聲時(shí)間為20 min時(shí)，多糖得率最大，之后隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)多糖提取有一定破壞，得率下降。由圖3B所示，多糖得率隨著超聲功率的增加出現(xiàn)了先降低再升高的情況，當(dāng)超聲功率為72 W，老芽菜多糖得率有峰值出現(xiàn)。由圖3C所示，多糖得率隨著料液比增加先增大后有小幅下降，考慮成本問(wèn)題選擇料液比為1∶20。由圖3D可見(jiàn)，當(dāng)浸提次數(shù)超過(guò)2次以上，多糖得率提高的并不明顯，從操作和經(jīng)濟(jì)方面考慮，確定多糖的浸提次數(shù)為2次。

圖3 不同工藝條件對(duì)老芽菜多糖超聲波提取得率的影響

2.3.2 超聲波提取老芽菜多糖的正交試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)時(shí)間(A)、功率(B)、料液比(C)、次數(shù)(D)進(jìn)行正交試驗(yàn)分析，設(shè)定正交表L9(34)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。老芽菜多糖超聲浸提法的影響效果是超聲時(shí)間>超聲功率>超聲次數(shù)>料液比，最佳提取條件為A2、B2、C1、D2，即超聲時(shí)間20 min、超聲功率72 W、料液比1∶20、超聲次數(shù)2次。通過(guò)方差分析所得，針對(duì)老芽菜多糖超聲輔助提取過(guò)程中，超聲時(shí)間影響最為顯著。

表5 超聲波提取的正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析

表6 超聲浸提的正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

2.4 老芽菜多糖不同提取工藝的比較

本試驗(yàn)采用熱水浸提法與超聲波提取法的最佳工藝提取老芽菜多糖，并對(duì)其多糖得率進(jìn)行比較，結(jié)果如表7。熱水提取法與超聲波提取法提取多糖的工藝中，超聲波浸提法的提取時(shí)間是熱水浸提工藝時(shí)間的14.8%，但是多糖的得率是熱水浸提工藝的1.19倍，而且操作簡(jiǎn)單，浸提次數(shù)少。主要是由于超聲波提取法是在水提取的基礎(chǔ)上進(jìn)行提取的，采用超聲波，產(chǎn)生高速、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)和攪拌作用破壞樣品細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)溶出，提高多糖得率。

表7 兩種提取方法的比較結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本文研究了老芽菜中多糖的不同提取工藝，熱水提取的溫度為70 ℃，時(shí)間為1.5 h，料液比為1∶20，提取次數(shù)為3次時(shí)，提取率最大為49.2 %。顯著性分析表明，浸提溫度是多糖熱水浸提工藝的顯著性影響因素。熱水浸提工藝是一種傳統(tǒng)的多糖提取工藝，工藝步驟簡(jiǎn)單，提取成本較低，然而，浸提次數(shù)較多，得率相對(duì)較低，整個(gè)工藝時(shí)間較長(zhǎng)。超聲波輔助提取過(guò)程中，可以造成細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生溫度和壓力差異，達(dá)到細(xì)胞破碎，有助于內(nèi)溶物流出，提高目標(biāo)物質(zhì)的提取率[17]。利用超聲波輔助提取的時(shí)間為20 min，提取功率72 W，料液比1∶20，提取次數(shù)2 次，提取率最大為58.7%。顯著性分析表明，超聲時(shí)間是多糖超聲輔助浸提工藝的顯著性影響因素。通過(guò)比較分析老芽菜利用超聲波輔助提取多糖的得率是熱水浸提的1.19倍。超聲波提取與熱水提取法相比，提取效率高、時(shí)間短、耗能低。并且超聲波提取過(guò)程不經(jīng)過(guò)高溫處理，可避免其多糖結(jié)構(gòu)的破壞，有助于其生物活性的保持。相較于山藥多糖的提取工藝，本研究的提取功率更低，提取時(shí)間更短，而且整個(gè)工藝過(guò)程是在室溫條件下進(jìn)行，有利于多糖活性的保持。由于原料的品種、產(chǎn)地及得率計(jì)算方法的不同，將造成不同研究報(bào)道的多糖得率存在較大差異。