有氧運動和二甲雙胍對2型糖尿病大鼠血管炎癥的影響及機制

李 俊, 王少兵, 許桂清, 姬麗麗, 劉一平

(1.南京信息工程大學 體育部,江蘇 南京 210044;2.福建師范大學 運動機能評定重點實驗室,福建 福州 350017)

糖尿病誘導的血管病變是導致糖尿病致殘、致死的主要原因。研究[1]表明,炎癥參與了2型糖尿病及血管并發(fā)癥的發(fā)病過程,2型糖尿病屬于慢性炎癥性疾病。糖尿病誘導的血管炎癥受到多種因素影響,包括高血糖、胰島素抵抗、脂質代謝紊亂和氧化應激等,其中高血糖和氧化應激能夠直接激活NF-κB炎癥信號通路,誘導炎癥基因的表達。因此,降低血管氧化應激程度,抑制炎癥信號對緩解糖尿病血管并發(fā)癥具有重要意義。目前對糖尿病的治療還沒有比較完善的方法,臨床治療主要以控制血糖為主,二甲雙胍是治療2型糖尿病常用的雙胍類藥物。糖尿病并發(fā)癥不僅與血糖水平有關,而且還受到遺傳、年齡、糖尿病病程和其他心血管風險因素的影響。除了臨床干預外,生活方式的改善,尤其是科學的運動鍛煉已被認為是預防和治療2型糖尿病的推薦方法。規(guī)律性有氧運動可以降低機體慢性炎癥,對心血管具有保護作用[2],但其作用機制還并不清楚。本文擬通過對2型糖尿病大鼠進行8周有氧運動和二甲雙胍干預,評價有氧運動、二甲雙胍和兩者聯(lián)合治療對2型糖尿病大鼠血管炎癥的影響,并初步探討其影響機制。

1 研究方法

1.1 實驗動物6周齡清潔級雄性SD大鼠45只[吳氏實驗動物中心提供,合格證號SCXK(閩)2012-0001],體質量200～250 g,分籠飼養(yǎng),自由進食飲水。室溫控制在22～24 ℃,濕度在50%～70%,晝夜循環(huán)。適應性喂養(yǎng)1周后,隨機選取6只作為正常組,并以普通飼料喂養(yǎng),其余39只為糖尿病組,采取高脂飼料喂養(yǎng)(15%蔗糖,15%豬油,5%蛋黃粉,0.2%膽酸鈉,64.8%基礎飼料)。4周喂養(yǎng)后,大鼠禁食12 h,高脂飲食組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ,溶于0.1 mol/L檸檬酸緩沖液),注射劑量為30 mg/kg,正常組同時腹腔注射相同容量的檸檬酸緩沖液。注射后注意觀察大鼠的攝食、飲水和排尿變化。STZ注射后第3、7、14天進行血糖監(jiān)測,最終空腹血糖值大于11.1 mmol/L的SD大鼠,確定為2型糖尿病。

1.2 研究設計

1.2.1 實驗分組 正常對照組(Con)6只。糖尿病模型組分為4組:糖尿病對照組(DM)7只;糖尿病二甲雙胍干預組(DM+Met)7只,給予喂食二甲雙胍藥物;糖尿病運動干預組(DM+Exe)9只,進行有氧運動干預;糖尿病藥物運動干預組(DM+Exe+Met)9只,同時進行有氧運動和二甲雙胍干預。干預時間為8周。

1.2.2 給藥方法 二甲雙胍的喂食劑量與方法參考已有研究[3-4]。將藥物溶入飲水瓶中,第1周劑量為150 mg.(kg·d)-1,第2周為300 mg.(kg·d)-1,第3周調整為400 mg.(kg·d)-1,該劑量一直保持到實驗結束,每日監(jiān)控大鼠飲水量,每周根據(jù)體質量變化調整一次藥物劑量。

1.2.3 運動方案 運動采用游泳方式。正式運動干預前,先進行1周適應性游泳訓練,第1次游泳時間為15 min,之后逐次增加10 min,共5次。正式干預為1 h/d,5d/周,共8周。第1～4周無負重游泳,第5～8周為1%體質量負荷。游泳池為圓形塑料桶,尺寸為60 cm(直徑)×75 cm(高),水深45～50 cm,水溫控制在32～35 ℃,每桶容納3只大鼠同時游泳。游泳過程中,時刻監(jiān)控大鼠游泳狀況,防止大鼠溺水淹死。

1.2.4 樣本制備 最后1次運動結束后24 h處死,處死前12 h禁食。血液標本以4 ℃,3 500 r.m-1離心10 min,取上清液,-20 ℃保存。迅速剝離主動脈放入冷凍管中,-80 ℃保存待用。

1.3 指標檢測

1.3.1 血糖檢測 大鼠禁食12 h,尾部采血,使用血糖儀和血糖試紙(羅氏卓越血糖儀及配套試紙)測定大鼠血糖濃度。

1.3.2 血清樣本檢測 總膽固醇(TC)、甘油三酯(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和總抗氧化能力(T-AOC)采用相應試劑盒檢測(南京建成生物工程研究所),胰島素(Insulin)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-10(IL-10)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)采用ELISA檢測法測定(南京建成生物工程研究所提供),以上指標檢測均按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.3 血管SOD活性和MDA濃度檢測 先將主動脈按1∶9比例加入生理鹽水、研磨,制作10%組織勻漿液,然后采用BCA法測量組織勻漿液的蛋白濃度(江蘇碧云天生物技術研究所提供),最后按照SOD和MDA檢測試劑盒說明書進行操作(南京建成生物工程研究所提供),并根據(jù)計算公式計算出組織勻漿液SOD活性和MDA濃度。

1.3.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳(Western Blotting) 將主動脈混合裂解液放入預冷的玻璃勻漿器中進行研磨,提取主動脈總蛋白,并采用BCA法檢測蛋白濃度。95 ℃加熱變性,-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｖ苽浞蛛x膠和濃縮膠,將蛋白樣品加入到上樣孔中,打開電源,直到溴酚藍到達電泳槽底部。電泳完成后,取下凝膠,轉膜1.5 h。轉膜后5%脫脂奶粉封閉1 h,一抗NF-κBp65、IκBα、GAPDH 4 ℃孵育過夜(Abcam,美國),洗膜,二抗室溫孵育1 h,洗膜。ECL化學發(fā)光顯色、拍照,并進行蛋白條帶灰度檢測。

1.3.5 熒光定量PCR 采用Trizol法提取主動脈總RNA,并測定RNA濃度。使用Revertaid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo fisher,美國)和SYBR Premix Ex TaqTMII(Takara,日本)試劑盒進行反轉錄和qPCR反應。引物序列:NF-κBp65:forward:5’-AGAGAAGC ACAGATACCACTAAGA-3’,reverse:5’-GTTCAGCCTCATAGAAGCCATC-3’;IκBα:forward:5’-CGAGCATTCTATTGTGGTGATTCA-3’,reverse:5’-CTACAGTCTATGGCGGTTCAAC-3’;VCAM-1:forward:5’-GTGAAGGAGTGAATCTGGTTGG-3’,reverse:5’-TCAGCGTCAGTGTGGATGTA-3’;GAPDH:forward:5’-ACGGCAAGTTCAACGGCACAG-3’,reverse:GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC-3’。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計運用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件,數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標準誤表示,組間差異分析采用單因素方差分析(one-way ANOVA),P<0.05為具有顯著性差異。

2 研究結果

2.1 有氧運動和二甲雙胍對大鼠糖脂代謝的影響從8周有氧運動和二甲雙胍干預后大鼠糖脂代謝的基本指標可見,DM組大鼠TC和TG明顯高于Con組。8周干預后,DM+Exe組和DM+Exe+Met組大鼠的糖脂代謝指標出現(xiàn)了不同程度的下降,但均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。DM組HDL-C水平顯著低于正常組(P<0.05),干預組大鼠HDL-C和LDL-C出現(xiàn)了一定程度的緩解狀態(tài)。在血糖代謝方面,DM組空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)顯著高于Con組(P<0.01),胰島素敏感指數(shù)(ISI)較低,DM+Met組和DM+Exe+Met組大鼠FBG下降幅度較為顯著,DM+Exe組雖然血糖低于糖尿病對照組,但無統(tǒng)計學差異。3種干預方式均顯著改善了糖尿病大鼠胰島素水平,其中DM+Exe+Met組在增加胰島素敏感性上的效果更加突出(表1)。

表1 大鼠糖脂代謝指標

注:n=(6-9)/group;a為P<0.05,A為P<0.01,versus Con group,b為P<0.05,B為P<0.01,versus DM group

2.2 有氧運動和二甲雙胍對大鼠血清炎癥標志物的影響8周干預后對大鼠血清炎癥指標及主動脈細胞黏附因子mRNA表達進行了檢測(圖1)。從圖1可見,DM組血清IL-1β、TNF-α、MCP-1和VCAM-1濃度均顯著高于正常組(P<0.01)。從干預結果看,干預組糖尿病大鼠IL-1β、TNF-α、MCP-1和VCAM-1都有下降的趨勢,但變化程度各不相同。DM+Met組降低幅度較小,DM+Exe組IL-1β、TNF-α、MCP-1和VCAM-1水平顯著低于DM組(P<0.05),DM+Exe+Met組血清TNF-α濃度顯著低于DM組、DM+Met組和DM+Exe組(P<0.05),MCP-1濃度顯著低于DM組(P<0.05)。Con組和DM組血清IL-10濃度較低,DM+Met組和DM+Exe+Met組血清IL-10濃度顯著高于正常對照組(P<0.05),其中DM+Exe+Met組顯著高于DM組(P<0.05)。在主動脈VCAM-1基因轉錄水平上,DM組VCAM-1mRNA表達水平顯著高于正常對照組,其中,DM組和DM+Met組與NC組相比,具有統(tǒng)計學差異(P<0.05),而DM+Met+Exe組VCAM-1mRNA表達水平顯著低于DM組(P<0.05),DM組、DM+Exe組和DM+Met組之間無明顯差異。

2.3 有氧運動和二甲雙胍對2型糖尿病大鼠血管氧化應激指標的影響8周有氧運動和二甲雙胍干預后,對大鼠氧化應激相關指標進行了檢測,包括血管組織SOD活性和MDA濃度以及血清總抗氧化能力(T-AOC)(圖2)。從圖2可見,DM組大鼠SOD和T-AOC水平最低,其中,DM+Exe組和DM+Exe+Met組大鼠血管組織SOD活性顯著高于DM組(P<0.05),在血清T-AOC上,僅DM+Exe+Met組大鼠與DM組相比,具有統(tǒng)計意義(P<0.05)。MDA反應了脂質過氧化及細胞損傷狀況,從圖2可見,DM組大鼠血管組織MDA濃度顯著高于Con組,有氧運動和二甲雙胍干預組大鼠血管組織MDA濃度均低于DM組,其中DM+Met組和DM+Exe+Met組大鼠MDA濃度與DM組相比,具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

2.4 有氧運動和二甲雙胍對2型糖尿病大鼠血管NF-κBp65和IκB蛋白及mRNA表達的影響NF-κBp65與抑制劑IκB在生理狀態(tài)下以失活狀態(tài)結合在細胞質中,當細胞受到刺激時,IκB被降解,NF-κBp65與IκB分離并轉位至細胞核中激活炎癥靶基因。本文從NF-κBp65與IκBα蛋白和mRNA的表達變化來反應NF-κB信號的激活狀態(tài)(圖3)。從圖3可見,DM組大鼠血管NF-κBp65蛋白表達量都顯著高于正常組, 8周有氧運動和二甲雙胍干預后,干預組NF-κBp65蛋白表達都低于DM組,其中DM+Exe組、DM+Exe+Met組與DM組相比,具有顯著性差異(P<0.05)。NF-κBp65mRNA表達與蛋白表達表現(xiàn)出類似的變化趨勢,DM+Exe組和DM+Exe+Met組大鼠NF-κBp65mRNA表達水平顯著低于DM

注:n=(6～9)/group,*表示P<0.05,**表示P<0.01,圖2同此

組(P<0.05)。

Con組大鼠血管組織IκBα蛋白表達最高,并顯著高于DM組、DM+Met組和DM+Exe組(P<0.01,P<0.05)。8周干預后,DM+Exe組和DM+Exe+Met組IκBα蛋白表達著高于DM組和DM+Met組(P<0.01)。在IκBα mRNA表達上,DM+Exe+Met組表達顯著高于其他組(P<0.05),除DM+Exe+Met組之外,其他各組大鼠血管組織IκBα mRNA表達無顯著差異。

3 分析與討論

3.1 有氧運動和二甲雙胍對2型糖尿病大鼠血管炎癥標志物的影響長期高血糖誘導的氧化應激損傷血管內皮細胞,并激活炎癥信號通路,促使血管發(fā)生炎癥反應。炎癥因子由多種組織細胞分泌并釋放到循環(huán)血液中,因此,循環(huán)血液中炎癥因子濃度并不能反映特異性組織的炎癥狀態(tài),但血管是儲存和運輸血液的主要器官,血管腔內的內皮細胞不斷受到循環(huán)血液的刺激,可認為循環(huán)血液中炎癥因子濃度在一定程度上反映血管的炎癥狀態(tài)。本文選取了促炎因子、趨化因子、細胞黏附分子、抗炎因子4種類型細胞因子以及主動脈細胞黏附分子基因表達反映血管炎癥。促炎因子IL-1β和TNF-α主要由單核巨噬細胞分泌,能夠激活內皮細胞炎癥信號通路,促使下游炎癥因子和細胞黏附分子的釋放,形成炎癥反應的正反饋循環(huán)。MCP-l是由單核巨噬細胞、脂肪細胞、內皮細胞等細胞分泌,主要功能是趨化單核細胞和T淋巴細胞,誘導單核細胞、內皮細胞表達黏附分子,誘導炎癥細胞向血管炎癥部位遷移[5]。細胞黏附分子VCAM-1特異表達于血管組織,其主要功能是促進白細胞和血管內皮細胞的黏附,在血管炎癥反應和血管平滑肌增生中發(fā)揮重要作用[6]。許多研究[7-9]將VCAM-1作為血管炎癥的重要指標。VCAM-1通常以可溶形式存在于血液中,血清中VCAM-1濃度可反映血管VCAM-1的表達量[10]。抗炎因子IL-10是由免疫和非免疫細胞分泌的一種抗炎因子,主要生物功能是抑制炎癥因子的產(chǎn)生,對單核細胞黏附內皮細胞具有抗炎作用[11]。

圖2 有氧運動與二甲雙胍對大鼠SOD、T-AOC和MDA影響Figure 2. Effects of aerobic exercise and metformin on SOD,T-AOC and MDA in rats

近年來研究顯示,二甲雙胍不僅具有降血糖功能,同時還具有抗炎作用[12]。本文結果顯示,二甲雙胍雖然能夠降低IL-1β,TNF-α、MCP-1和VCAM-1水平,但影響幅度相對較小,近期的研究也顯示了類似的結果[3]。有氧運動與聯(lián)合干預可以不同程度地降低血清IL-1β、TNF-α、MCP-1和VCMA-1水平,說明有氧運動與聯(lián)合干預可以改善血管炎癥,但對不同炎癥因子的影響不同。之前的研究顯示,長期規(guī)律性運動可以降低血清IL-1β、TNF-α和MCP-1水平,緩解機體炎癥[13-14]。從本文數(shù)據(jù)看,運動組血清IL-1β濃度明顯降低,而聯(lián)合干預組濃度雖然有所下降,但無統(tǒng)計學差異,這可能是由于二甲雙胍通過某種途徑限制了運動效應,但其機制并不清楚。此外,有氧運動與聯(lián)合干預均可以顯著降低血清TNF-α、MCP-1和VCAM-1濃度,說明有氧運動和二甲雙胍對降低糖尿病大鼠血清炎癥標志物具有一定的作用。

雖然發(fā)現(xiàn)了運動能夠緩解機體炎癥這一作用特征,但其作用機制還并不清楚。研究[15]認為,運動具有抗炎效應,骨骼肌細胞分泌的IL-6具有抗炎作用,能夠抑制TNF-α和IL-1β分泌,同時還能促進抗炎因子如IL-10和IL-1ra的分泌。本文對IL-10進行了檢測,發(fā)現(xiàn)二甲雙胍和運動聯(lián)合干預能夠顯著提高糖尿病大鼠IL-10的濃度,說明二甲雙胍和運動聯(lián)合干預具有直接抗炎作用。Babbitt等[16]對高血壓人群進行6個月的有氧運動干預后發(fā)現(xiàn),有氧運動可增加IL-10濃度,但無顯著性差異,這與本文結果相似。此外,該研究還發(fā)現(xiàn)最大攝氧量變化可以預測IL-10濃度的變化,認為心肺耐力改善與血清IL-10濃度的增加有關。

注:n=6/group,(a)為NF-κBp65蛋白表達,(b)為NF-κBp65 mRNA表達,(c)為IκBα蛋白表達,(d)為IκBαmRNA表達

3.2 有氧運動和二甲雙胍對2型糖尿病大鼠糖脂代謝的影響高血糖、胰島素抵抗、脂質代謝紊亂等因素均可能誘導血管炎癥的發(fā)生。本文數(shù)據(jù)顯示,二甲雙胍、有氧運動及聯(lián)合治療均可改善2型糖尿病大鼠血糖,但二甲雙胍和聯(lián)合干預組與有氧運動組相比在控制血糖方面具有更加明顯的優(yōu)勢。二甲雙胍主要是通過降低肝臟糖異生作用,抑制腸系膜細胞吸收,維持血糖平衡[17]。運動可以通過增加骨骼肌對血糖的吸收降低血糖[18]。數(shù)據(jù)還顯示了聯(lián)合干預在改善糖尿病大鼠胰島素敏感性上要優(yōu)于單純藥物和運動的治療效果,這說明二甲雙胍和運動在改善胰島素敏感性上可能存在協(xié)同效應,這與之前的研究結果一致[4,19]。運動能夠通過影響胰島素信號轉導通路逆轉胰島素抵抗的發(fā)生,改善胰島素敏感性[20],二甲雙胍可能是通過激活骨骼肌AMPK信號來增加外周胰島素敏感性[21]。由此可見,有氧運動和二甲雙胍可能部分通過降低血糖和胰島素改善糖尿病大鼠血管炎癥。

3.3 有氧運動和二甲雙胍對2型糖尿病大鼠血管氧化應激的影響氧化應激在許多疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。糖尿病狀態(tài)下高血糖和脂質代謝紊亂能夠引起氧化應激信號通路的激活,誘導機體產(chǎn)生過多的ROS,損傷血管內皮細胞,并通過激活NF-κB炎癥信號,誘導炎癥基因如MCP-1,ICAM-1和VCAM-1的表達[22-23]。氧化應激不僅參與了糖尿病的發(fā)病過程,也構成了糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病機制[24]。因此,降低氧化應激對減輕血管內皮損傷,緩解血管炎癥起到重要作用。

本文數(shù)據(jù)顯示了8周有氧運動與聯(lián)合干預能夠明顯緩解糖尿病大鼠血管氧化應激。之前研究[12]顯示,二甲雙胍具有抗氧化功能。雖然在本文中,單純給予二甲雙胍處理并不能顯著降低糖尿病大鼠血管氧化應激,但仍可看出二甲雙胍的抗氧化作用。大量研究[25-27]表明,長期運動可以提高機體抗氧化功能,但其機制并不清楚。近年來,有研究報道[28]規(guī)律性長期運動能夠激活嚙齒類動物多種組織細胞抗氧化轉錄因子Nrf2信號及其下游抗氧化基因的表達,認為Nrf2信號在運動抗氧化效應中發(fā)揮重要作用。內皮細胞Nrf2是血流切應力敏感性轉錄因子[29],運動誘導的血流切應力可能是激活內皮Nrf2信號的原因之一。有氧運動、二甲雙胍和聯(lián)合干預能夠減輕糖尿病大鼠血管氧化應激,同時對血管炎癥又能起到一定的療效作用。基于此,可以推測有氧運動和二甲雙胍有可能通過降低氧化應激緩解糖尿病大鼠血管炎癥。

3.4 有氧運動和二甲雙胍對2型糖尿病大鼠主動脈NF-κB信號的影響核轉錄因子NF-κB介導的信號傳導是炎癥反應中最重要的信號通路。該信號參與細胞炎癥反應,促進凝血和促炎基因的表達,在動脈粥樣硬化和糖尿病血管并發(fā)癥中發(fā)揮關鍵的作用。在生理狀態(tài)下,NF-κB亞基p65與抑制劑IκB以失活狀態(tài)結合在細胞質中,當細胞受到促炎因子如TNF-α、IL-1β或ROS等刺激時,細胞內IKK信號被激活,導致IκB磷酸化,并被蛋白酶降解,細胞質內p65脫離IκB,并轉位至細胞核,激活下游特定靶基因如TNF-α、VCAM-1、MCP-1、IL-1β等的表達[30]。高糖和脂質誘導的血管內皮NF-κB信號通路激活,能夠增加局部炎癥反應,損傷內皮細胞功能,促進內皮細胞凋亡[31]。

本文顯示,糖尿病對照組主動脈NF-κBp65表達水平顯著高于正常對照組,但僅通過NF-κBp65還不能判斷該炎癥信號通路的激活。因此,對NF-κBp65抑制劑IκBα進行了檢測,發(fā)現(xiàn)糖尿病對照組IκBα蛋白表達量明顯低于正常組,說明糖尿病對照組大鼠血管細胞NF-κBp65可能已經(jīng)脫離IκB轉位至細胞核。同時,數(shù)據(jù)顯示了糖尿病對照組已表現(xiàn)出較高的IL-1β、TNF-α、MCP-1和VCAM-1濃度水平,而這些細胞因子又受到NF-κB信號的調控,可以推測,糖尿病可能通過激活NF-κB信號促進下游炎癥因子的表達。IL-1β和TNF-α的增加可以繼續(xù)激活NF-κB信號,形成正反饋循環(huán),進一步加重炎癥反應[32]。 8周有氧運動和聯(lián)合干預能夠明顯下調NF-κBp65蛋白和mRNA表達水平,上調IκBα蛋白表達,同時有氧運動和聯(lián)合干預組血清IL-1β、TNF-α、MCP-1和VCAM-1濃度明顯低于糖尿病對照組,說明有氧運動和聯(lián)合干預可能通過抑制NF-κB信號來減輕血管炎癥。單純二甲雙胍處理并不能影響NF-κB信號。雖然研究表明二甲雙胍具有抗炎作用,但是否通過NF-κB信號達到抗炎作用還存在爭議[33-34]。有研究[35]顯示,8周游泳干預能夠明顯降低動脈粥樣衰老大鼠動脈NF-κB信號以及TNF-α和VCAM-1蛋白表達。還有研究[36]顯示,運動可以通過降低TLR4,抑制內皮細胞NF-κB信號的激活,減少黏附分子的表達,與本文結果相似。因此可以認為,有氧運動及聯(lián)合干預可能部分通過抑制血管NF-κB信號及下游IL-1β、TNF-α、MCP-1和VCAM-1等炎癥因子表達,緩解糖尿病大鼠血管炎癥。

4 結論

有氧運動和二甲雙胍均能降低2型糖尿病大鼠血管炎癥,其中有氧運動和聯(lián)合干預對血管炎癥的治療效果優(yōu)于二甲雙胍干預。有氧運動和二甲雙胍可能通過改善2型糖尿病大鼠血糖代謝,降低血管氧化應激緩解血管炎癥。有氧運動與二甲雙胍可能部分通過抑制血管NF-κB信號緩解2型糖尿病大鼠的血管炎癥。