GSK3β在HGF信號通路中對改善心肌缺血再灌注損傷的作用研究*

潘艷艷，史斌浩，馬夢晴，林先和

(安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心血管內科，合肥 230022)

心血管疾病(cardiovascular diseases，CVD)仍是世界范圍內導致患者死亡的主要原因，包括冠狀動脈疾病、冠心病和缺血性心臟疾病，已成為全球性公共健康問題。隨著經濟的發(fā)展和生活水平的提高，人們生活作息和飲食習慣的改變，心肌梗死(myocardial infarction，MI)的發(fā)病率呈上升趨勢[1]。臨床上以改善缺血，盡早恢復心肌血流灌注，減少MI面積為治療的首要原則[2]。大量研究表明，在缺血期除了細胞凋亡、壞死等促細胞死亡的機制外，還存在著細胞自噬(autophagy)等促細胞存活機制[3]。自噬是一種進化上保守的細胞內自我保護機制，細胞內多余的蛋白質聚集體和受損細胞器被隔離到自噬小泡中，隨后與溶酶體融合降解[4]。在缺血狀態(tài)下，心肌細胞可以通過不同的信號通路調控自噬系統(tǒng)，自噬的發(fā)生可促進對受損蛋白、脂質和細胞器等廢物的清除[3]。因此，自噬被認為是心肌細胞對抗缺血性損傷的主要保護機制。既往研究表明，肝細胞生長因子(HGF)與其受體(Met)的結合可以激活下游信號通路促進自噬，與多種組織疾病自噬密切相關，如肺癌、結腸直腸癌、高糖性腎足細胞損傷等[5]。糖原合成激酶3β(GSK3β)是HGF下游通路中的一個重要通路蛋白，其活性的抑制可以激活多種下游通路對抗心肌缺血再灌注損傷引起的炎性反應，鈣超載和氧化應激反應等[6]。有研究發(fā)現抑制GSK3β可以激活不同的信號通路，如腺苷單磷酸激活蛋白激酶(AMPK)通路、Beclin-1通路，可以調控多種疾病自噬[7-8]。然而，GSK3β在HGF促進自噬對抗缺心肌血再灌注損傷中的作用少見報道。本研究通過建立立體大鼠心肌細胞缺血再灌注模型，觀察內源性HGF和磷酸化GSK3β(pGSK3β)的表達情況及下游通路蛋白和自噬相關蛋白的表達水平，研究HGF通過促進GSK3β的磷酸化調控自噬在減輕大鼠心肌細胞缺血再灌注損傷中的相關作用。

1 材料與方法

1.1主要材料 AMPK、肝激酶B1(LKB1)、HGF抗體(美國Affinity Biosciences公司)；LC3Ⅱ抗體(美國Abcam公司)；HRP-羊抗小鼠IgG、HRP-羊抗兔IgG、 β-actin、蛋白激酶B(Akt)抗體(上海Bioss公司)；腺病毒(上海Hanbio生物科技有限公司)；超敏型ECL發(fā)光液(美國 Advansta公司)；胎牛血清(上海雙洳生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1細胞系的選擇及培養(yǎng) 選用大鼠離體心肌細胞H9c2細胞系，90%高糖培養(yǎng)基(DMEM)、10%小牛血清及1%雙抗(青霉素、鏈霉素)配成的培養(yǎng)基置于37 ℃ 5%CO2環(huán)境下的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，取生長良好的細胞種植于6孔細胞培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)備用。

1.2.2實驗模型制備 實驗分為正常對照組和實驗組，實驗組分別為缺血再灌注(I/R)組、I/R+HGF組、I/R+HGF+Ad-GFP組(不表達GSK3β的重組腺病毒Ad-GFP)、I/R+HGF+GSK3β-Ad-wt組(野生型GSK3β腺病毒GSK3β-Ad-wt)、I/R+HGF+GSK3β-Ad-S9A組[表達GSK3β不可磷酸化的組成型活性突變體，其第9位絲氨酸殘基突變(Ser9)為丙氨酸，從而不能再被磷酸化失活而具有固有活性的GSK3β腺病毒GSK3β-Ad-S9A]和I/R+HGF+GSK3β-Ad-K85A組(表達催化失活的GSK3β復制缺陷型腺病毒載體，其第85位賴氨酸殘基突變?yōu)榧琢虬彼幔瑥亩掷m(xù)失活的GSK3β腺病毒GSK3β-Ad-K85A)。腺病毒感染方法為細胞貼壁于6孔細胞培養(yǎng)板，吸去原有培養(yǎng)基，加入1 mL新鮮培養(yǎng)基，選定多重感染(MOI)為100單位對應的病毒原液體積加入細胞中，搖勻。放入37 ℃培養(yǎng)箱中感染2 h，吸去含病毒的培養(yǎng)液，PBS清洗2次，加入新鮮的培養(yǎng)液。HGF激活劑組加入HGF激活劑(20 ng/mL)，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后更換新鮮培養(yǎng)液2 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后制備I/R模型。分別吸出6組實驗組中的完全培養(yǎng)基，加入2 mL缺血模擬液(NaCl 98.5 mmol/L，KCl 10 mmol/L，NaH2PO40.9 mmol/L，NaHCO36.0 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L，MgSO41.2 mmol/L，乳酸鈉40 mmol/L，HEPES 20 mmol/L)并置于低氧細胞培養(yǎng)箱(95% N2，5% CO2，37 ℃)中培養(yǎng)12 h，吸出缺血模擬液，加入2 mL完全培養(yǎng)基于普通培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h。

1.2.3檢測指標 采用Western blot檢測Akt、GSK3β、LKB1、AMPK、LC3Ⅱ、Beclin-1表達。 模型制備完后，將培養(yǎng)板置于冰盒上，用預冷的PBS清洗2次，吸盡PBS，加入裂解液搖床上裂解30 min，用細胞刮刮至1.5 mL的EP管中，4 ℃ 12 000 r/min離心30 min，輕輕吸取上清液加入其1/4的SDS上樣緩沖液，沸水中煮10 min，進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，之后將蛋白轉于聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。聚偏氟乙烯(PVDF)膜用含50 g/L脫脂奶粉的TBST溶液封閉3 h。將含有蛋白的聚偏氟乙烯(PVDF)膜置于1∶1 000或1∶300的目標蛋白抗體的一抗稀釋液中4 ℃過夜孵育，TBST沖洗3次，每次15 min，分別使用對應的1∶10 000二抗孵育1 h，TBST沖洗3次，每次15 min。最后用超敏型ECL發(fā)光液進行曝光顯影，顯影儀Bio-Rad成像系統(tǒng)拍照，Image J軟件分析蛋白的相對表達量。

2 結 果

2.1各組GSK3β、pGSK3β表達情況 與對照組和I/R組比較，I/R+HGF組GSK3β的總表達量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而pGSK3β的表達量明顯增加(P<0.05)。在HGF激活劑的刺激下，各GSK3β感染組的GSK3β的總表達量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，I/R+HGF+GSK3β-Ad-wt組的GSK3β總表達量較低(P<0.05)。I/R+HGF+GSK3β-Ad-wt組和I/R+HGF+GSK3β-Ad-K85A組的pGSK3β明顯升高(P<0.05)，而I/R+HGF+GSK3β-Ad-S9A組降低(P<0.05)，見圖1。

1:對照組;2:I/R組;3:I/R+HGF組；4：I/R+HGF+Ad-GFP組；5：I/R+HGF+GSK3β-Ad-wt組；6:I/R+HGF+GSK3β-Ad-S9A組;7：I/R+HGF+GSK3β-Ad-K85A組；a：P<0.05與對照組比較；b：P<0.05，與I/R組比較；c：P<0.05，與I/R+HGF組比較

圖1 各組GSK3β、pGSK3β表達情況

2.2各組LKB1、AMPK表達情況 與對照組比較，I/R組的LKB1和AMPK的表達量明顯升高(P<0.05)。與I/R組相比，I/R+HGF組LKB1和AMPK的表達量明顯升高(P<0.05)。在HGF激活劑的作用下，I/R+HGF+GSK3β-Ad-wt組和I/R+HGF+GSK3β-Ad-K85A組的LKB1和AMPK明顯升高(P<0.05)，而I/R+HGF+GSK3β-Ad-S9A組降低(P<0.05)，見圖2。

2.3各組LC3Ⅱ、Beclin-1表達情況 與對照組比較，I/R組LC3Ⅱ、Beclin-1的表達量明顯升高(P<0.05)。與I/R組相比，I/R+HGF組LC3Ⅱ、Beclin-1的表達量明顯升高(P<0.05)。在HGF激活劑的作用下，I/R+HGF+GSK3β-Ad-wt組和I/R+HGF+GSK3β-Ad-K85A組的LC3Ⅱ、Beclin-1明顯升高(P<0.05)，而I/R+HGF+GSK3β-Ad-S9A組降低(P<0.05)，見圖3。

1:對照組;2:I/R組;3:I/R+HGF組；4：I/R+HGF+Ad-GFP組；5：I/R+HGF+GSK3β-Ad-wt組；6:I/R+HGF+GSK3β-Ad-S9A組;7：I/R+HGF+GSK3β-Ad-K85A組；a：P<0.05與對照組比較；b：P<0.05，與I/R組比較；c：P<0.05，與I/R+HGF組比較

圖2 各組LKB1、AMPK表達情況

1:對照組;2:I/R組;3:I/R+HGF組；4：I/R+HGF+Ad-GFP組；5：I/R+HGF+GSK3β-Ad-wt組；6:I/R+HGF+GSK3β-Ad-S9A組;7：I/R+HGF+GSK3β-Ad-K85A組；a：P<0.05與對照組比較；b：P<0.05，與I/R組比較；c：P<0.05，與I/R+HGF組比較

圖3 各組LC3Ⅱ、Beclin-1表達情況

2.4各組Akt表達情況 與對照組比較，I/R組的pAkt(Akt的Ser473位點磷酸化)的表達量明顯升高(P<0.05)。與I/R組比較，I/R+HGF組pAkt明顯升高(P<0.05)。而在HGF激活劑的作用下，各感染組的pAkt表達量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

1:對照組;2:I/R組;3:I/R+HGF組；4：I/R+HGF+Ad-GFP組；5：I/R+HGF+GSK3β-Ad-wt組；6:I/R+HGF+GSK3β-Ad-S9A組;7：I/R+HGF+GSK3β-Ad-K85A組；a：P<0.05與對照組比較；b：P<0.05，與I/R組比較；c：P<0.05，與I/R+HGF組比較

圖4 各組Akt表達情況

3 討 論

GSK3β是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸酶。GSK3β已被證明作用于多種信號蛋白和轉錄因子，調節(jié)細胞的分化、增殖、存活和凋亡[9]。既往研究表明，GSK3β在Ser9位點磷酸化從而失去活性在心肌缺血再灌注引起的炎性反應，鈣超載和氧化應激反應等中具有抗炎和抗凋亡作用，從而保護心肌細胞，其機制可能與其提高線粒體的通透性轉換孔(mPTP)開放閾值，減少線粒體損傷，細胞凋亡和壞死相關[6]。GSK3β作為HGF/Met信號通路中的一個下游信號蛋白，在HGF/Met的抗炎、抗凋亡等多種組織保護機制中起著關鍵性作用[7-8]。而GSK3β在心肌細胞發(fā)生缺血再灌注時HGF/Met信號通路促進自噬，保護心肌細胞中的作用，缺乏相關報道。

當心肌發(fā)生缺血再灌注時，除心肌細胞的壞死和凋亡程度影響預后，自噬的發(fā)生同樣也影響心肌的梗死面積和存活[3]。其機制可能是當心肌發(fā)生缺血時，細胞的能量缺乏促進AMPK的激活，導致自噬基因Beclin-1的蘇氨酸388位點產生磷酸化，促使自噬基因Beclin-1與Bcl-2解離，促進自噬相關蛋白Beclin-1和VPS34及Atg14的結合形成三聚體復合物，三聚體再不斷地招募相關的核心蛋白，作為自噬起始；在自噬體的延長階段，LC3Ⅰ會被包括Atg7和Atg3在內的泛素樣體系所修飾和加工，產生相對分子質量為14×103的LC3Ⅱ，并定位到自噬小體中。這樣，自噬小體中存在的LC3和低分子量的LC3Ⅱ都被當作細胞發(fā)生自噬的分子標志，并且LC3Ⅱ的含量和發(fā)生自噬的程度成正比。因此這兩個蛋白可以作為自噬水平的檢測指標[10]。本實驗通過腺病毒轉染大鼠離體心肌細胞的方法使GSK3β不同的位點發(fā)生突變從而使GSK3β處于持續(xù)失活或激活狀態(tài)，并通過建立缺血再灌注模型，以GSK3β下游通路蛋白和自噬相關蛋白為指標研究在HGF激活劑的作用下，GSK3β的失活對促進細胞自噬，減輕細胞損傷的相關作用[11]。既往研究結果顯示，在缺血狀態(tài)下，HGF的激活可以激活下游PI3K/Akt/Bcl-2信號通路從而抑制細胞凋亡，保護心肌細胞[12]。GSK3β作為PI3K/Akt的下游信號蛋白在缺血時同樣發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現，抑制GSK3β的活性(GSK3β的Ser9位點磷酸化)能有效提高線粒體mPTP的開放閾值，減少線粒體損傷、細胞凋亡和壞死的發(fā)生[13]。本實驗結果顯示，與對照組相比，I/R組AMPK的表達量明顯升高，驗證了心肌細胞在發(fā)生缺血時會產生一定量的自噬。AMPK的激活與其上游基因LKB1的活性有關。在之前的報道中表明，GSK3β去磷酸化將會抑制LKB1的活性。本實驗結果顯示，HGF促進了pAkt、pGSK3β的表達，以及下游通路蛋白LKB1、AMPK和自噬相關蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ的表達。證實了在缺血狀態(tài)下，HGF對心肌細胞自噬的促進作用及GSK3β在HGF促進自噬中的可能性的潛在性作用。而在HGF激活劑的作用下，GSK3β的失活(Ad-wt和Ad-K85A腺病毒感染組)使下游通路蛋白LKB1、AMPK和自噬相關蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ的表達量明顯升高。表明了HGF/Met信號通路在心肌缺血再灌注損傷中通過抑制GSK3β的活性，促進細胞自噬到達保護作用。而持續(xù)激活GSK3β的Ad-S9A腺病毒感染組中自噬呈減弱趨勢，可能導致心肌細胞加速損傷。

既往研究發(fā)現，HGF與其受體的結合可以激活下游信號蛋白PI3K/Akt，而PI3K/Akt的激活可以促進下游信號蛋白GSK3β在Ser9位點發(fā)生磷酸化，失去活性[6]。在心血管系統(tǒng)中，GSK3β在葡萄糖代謝、心肌肥厚和細胞死亡等病理過程中起著關鍵性作用[14]。在慢性腦缺血性疾病中，增加GSK3β的磷酸化會導致pmTOR的水平增加及Beclin-1水平的降低，從而抑制細胞破壞性自噬的活性。在對高糖血癥和血脂異常的人主動脈內皮細胞的研究中發(fā)現，抑制GSK3β的活性可以通過增加AMPK的活性增加自噬體的形成，從而減少內皮細胞的死亡及動脈粥樣硬化的形成[15]。結合本實驗結果，表明GSK3β在HGF保護心肌對抗缺血再灌注損傷中起著重要的作用。本實驗從蛋白水平證實了HGF通路的激活可以通過促進細胞自噬保護心肌細胞在缺血再灌注中的損傷，其可能機制是PI3K/Akt/GSK3β/AMPK信號通路的激活，但其是否存在其他可能的分子機制及作用靶點尚不明確，仍待進一步完善。

心肌細胞是一種高度分化的永久性細胞，其損傷往往是不可逆的，會引起致命性損傷。故減少心肌細胞的損傷和死亡對保護心臟極為重要。自噬在缺血再灌注中對心肌細胞起保護作用的同時也會引起細胞自噬性死亡，進一步加重心肌細胞的受損。因此，避免或盡最大程度地降低自噬在缺血再灌注損傷引起的細胞死亡將可能成為未來治療冠心病的重要環(huán)節(jié)。