小檗堿改善血管性癡呆大鼠學習記憶與P38MAPK 通路的關系

秦鵬飛 談陳界 柴松琦 嚴嘉寧 趙立峰 韋登明

(寧波大學醫學院病理教研室,浙江 寧波 315211)

血管性癡呆(VD)是主要由缺血性腦血管疾病導致的認知障礙綜合征。單核細胞趨化蛋白(MCP)-1作為炎性趨化蛋白，在VD的腦組織炎性損傷中起了重要的作用。P38絲裂原活化蛋白激酶級聯途徑(P38MAPK通路)和腦缺血再灌注損傷密切相關〔1,2〕，主要參與了炎性應激反應，但是否參與MCP-1介導的VD腦損傷，少見文獻報道。小檗堿能夠減弱炎癥遞質釋放，抑制炎癥細胞的分化和趨化，從而產生抗炎作用〔3〕。而小檗堿改善VD患者認知功能的機制是否與小檗堿影響MCP-1和P38MAPK表達有關，目前尚未有相關研究。本實驗通過檢測小檗堿對VD大鼠海馬區MCP-1和P38MAPK蛋白含量的影響，研究其對VD學習記憶的改善效果及相關機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 健康清潔級Wistar大鼠60只，體重200～250 g，雄性，由寧波大學實驗動物中心提供，許可證號：SYXK(浙)2013-0191。大鼠自由飲食，適應性喂養7 d后，分為正常組，假手術組，模型組和小檗堿低、中、高劑量組，每組10只。

1.2試劑儀器 小檗堿(阿拉丁試劑上海有限公司)，水迷宮程序自動控制儀(上海移數動物學系統)；兔抗大鼠P38MAPK、MCP-1 多克隆抗體，生物素化羊抗兔 IgG、SABC 試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；JD801形態學圖像分析系統(江蘇捷達科技發展有限公司)，BM-Ⅶ包埋機(宏業醫用儀器公司)；HM-325石蠟切片機(德國LEICA公司)；CX40生物顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3模型制備 采用王蕊等〔4〕的方法稍加改進后造模。10%水合氯醛按35 mg/kg進行腹腔注射麻醉大鼠。大鼠仰臥固定，切開頸部正中皮膚，鈍性分離，暴露右側頸總動脈(CCA)，隨即分離CCA(同時分離迷走神經)，然后穿線。將硝普鈉按3.5 mg/kg的劑量腹腔注射以降低血壓。CCA用動脈夾夾閉30 min，隨即再通1 h，再次夾閉30 min。碘酒消毒后縫合，放回到鼠籠中保溫飼養。假手術組麻醉及手術過程同上，但不夾閉CCA。術后，每只大鼠連續3 d肌肉注射青霉素16萬U。飼養7 d后，按Longa 5分法標準進行評判，2分及以上為造模成功大鼠。

1.4給藥方法 小檗堿各劑量組造模前持續給藥7 d，每日1次，按150 mg/kg(高劑量組)、100 mg/kg(中劑量組)、50 mg/kg(低劑量組)的劑量腹腔注射；模型組和假手術組、正常組在同樣的時間點注射1 ml/100 g生理鹽水。造模后小檗堿各劑量組仍予小檗堿治療，共14 d，按150 mg/kg(高劑量組)、100 mg/kg(中劑量組)、50 mg/kg(為低劑量組)腹腔注射，1次/d；模型組、假手術組和正常組同時給予腹腔注射1 ml/100 g的生理鹽水。

1.5行為學檢測 采用Morris水迷宮試驗〔5〕，共計5 d，每天早晨檢測一次，將各組大鼠分別從兩個入水點面向池壁放入水中，記下大鼠在90 s內游上平臺的時間(逃避潛伏期)，以此來檢測其學習能力。

1.6海馬神經元凋亡形態學觀察 以10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉大鼠，斷頭取腦，置于冰盤，分離海馬體。常規脫水、用石蠟包埋，含海馬連續切片，蘇木精-伊紅(HE)染色。每例取3張切片，盡量使每張切片斷面相似，隨機選擇10個海馬CA3區，高倍鏡(40×10倍)下計數神經元凋亡數目，計算凋亡細胞所占的百分比〔6〕。

1.7免疫組織化學方法檢測P38MAPK通路蛋白和MCP-1表達 石蠟包埋切片后進行免疫組織化學染色。切片經常規脫臘、脫水、3%H2O2滅活內源性酶、微波抗原修復，小心洗滌，使用正常山羊血清封閉，分別滴入一抗P38MAPK(1∶500)和MCP-1(1∶100)，置于濕盒中4℃冰箱環境過夜。滴加二抗為生物素化羊抗兔IgG，進行SABC反應和二氨基聯苯胺(DAB)顯色。最后經復染、脫水、透明、封片，于光鏡下進行免疫組化染色觀察，胞質呈紅褐色為陽性區域。光鏡(40×10倍)下隨機選取每張切片的4個視野，計算平均積分光密度。

1.8統計學處理 采用SPSS13.10軟件行單因素方差分析，兩組間數據比較采用SNK檢驗。

2 結 果

2.1小檗堿對各組大鼠行為學表現的影響 隨著訓練天數的增加，各組均出現逃避潛伏期明顯縮短的情況，相比于正常組，假手術組的逃避潛伏期差異無統計學意義(P>0.05)。與假手術組比較，模型組的逃避潛伏期明顯增加(P<0.05)；而小檗堿各劑量組較模型組的逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)，且隨小檗堿劑量增大，大鼠的逃避潛伏期顯著縮短，存在劑量依賴現象。見表1。

表1 各組水迷宮試驗不同時間點逃避潛伏期

與正常組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；與高劑量組比較：3)P<0.05；與中劑量組比較：4)P<0.05；下表同

2.2小檗堿對各組大鼠海馬神經元凋亡的影響 正常組和假手術組大鼠海馬神經元正常，未見明顯凋亡，神經元凋亡率分別為(2.22±0.72)%、(1.78±0.17)%。模型組大鼠海馬存在大量凋亡細胞，神經元凋亡率為(51.67±8.04)%；經小檗堿治療后，各治療組大鼠海馬神經元凋亡明顯減少，高、中、低劑量組神經元凋亡率分別為(34.11±2.40)%、(40.23±4.45)%、(44.40±4.96)%，與模型組比較差異顯著(P<0.05)。

2.3小檗堿對各組大鼠海馬P38MAPK和MCP-1表達的影響 在正常組與假手術組，大鼠的海馬神經細胞僅見少量P38MAPK和MCP-1陽性表達。模型組比假手術組P38MAPK和MCP-1表達明顯增加(P<0.05)。經小檗堿治療后，與模型組相比，各劑量組海馬神經細胞P38MAPK和MCP-1的陽性表達明顯減少(P<0.05)，見表2。

表2 小檗堿對各組海馬P38MAPK和MCP-1表達的影響積分光密度)

3 討 論

腦缺血引起行為學障礙是當前進行VD研究的最常用的經典造模方法。本研究采用阻斷動脈的方法制作VD模型，經過Morris水迷宮試驗證明模型組大鼠學習能力明顯減弱，表明本次造模成功〔7〕。MCP-1在VD腦組織的炎性損傷中扮演了重要角色，MCP-1 的大量表達直接關系到腦缺血損傷后單核細胞聚集和神經膠質細胞活化，膠質細胞活化后可產生自由基，通過神經毒素的釋放間接造成缺血腦損傷，導致神經細胞變性和壞死〔8〕。P38MAPK通路與腦缺血再灌注中神經細胞大量損傷有著密切聯系。VD會導致P38MAPK激活,而抑制P38MAPK的作用能有效保護神經細胞免受缺血再灌注損傷。小檗堿也稱黃連素,是一種四氫異喹啉類生物堿,可以減少炎癥介質如MCP-1的釋放并抑制其趨化，從而減輕局部炎癥反應〔9〕，這對減弱神經元壞死凋亡、保護大腦的認知能力起到了至關重要的作用。魏佑震等〔10，11〕證實小檗堿對腦缺血后再灌注損傷的海馬CA1區神經元有保護作用。本研究表明小檗堿對VD大鼠的學習記憶能力有改善作用，能保護VD大鼠大腦的海馬區神經元。免疫組織化學試驗結果顯示小檗堿治療后MCP-1和P38MAPK表達明顯降低，因此，筆者認為MCP-1和P38MAPK的高表達參與了VD腦損傷過程，而小檗堿可能通過對MCP-1和P38MAPK表達的抑制對大鼠海馬區神經元產生保護作用，從而增強VD大鼠的學習記憶能力。