survivin對血小板源生長因子刺激的人視網膜色素上皮細胞增殖的影響及機制

孟巖 劉宏偉 孫鵬

(佳木斯大學附屬第一醫院眼科，黑龍江 佳木斯 154002)

眼內出血、孔源性視網膜脫離、眼球穿通傷和視網膜脫離復位手術以后，視網膜表面、玻璃體內的細胞增生及收縮會引起牽引性的視網膜脫離，稱為增生性玻璃體視網膜病變，該病的發生與血小板源生長因子(PDGF)有關，其可以促進細胞分裂，誘導視網膜色素上皮細胞增殖，而視網膜色素上皮細胞過度增殖是增生性玻璃體視網膜病變發生的重要原因之一，因此，研究抑制PDGF對視網膜色素上皮細胞增殖誘導作用對于防治相關眼病的發生具有十分重要的意義〔1～3〕。survivin是一種與細胞凋亡有關的調控基因，其是一種凋亡抑制因子，能夠促進細胞增殖、抑制細胞凋亡，在生命體正常生理功能維持中具有重要作用〔4,5〕。研究表明，survivin反義核苷酸可以誘導人視網膜色素上皮細胞凋亡，并且在人視網膜色素上皮細胞凋亡中表達下調〔6,7〕。本實驗探討survivin在PDGF處理的人視網膜色素上皮細胞增殖凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 人視網膜色素上皮細胞hRPE購自北京北納創聯生物技術研究院；JC-1染液線粒體膜電位檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；胞質蛋白提取試劑盒購自上海浩然生物技術有限公司；cDNA合成試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；qRT-PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher；引物均由金斯瑞生物科技有限公司合成；survivin抗體購自美國Pllaboratories；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen；PDGF購自美國R&D；siRNA control和survivin siRNA由上海吉凱基因化學公司合成；剪切型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase-3)、細胞色素(Cyt)C抗體購自美國CTS。

1.2實驗分組 人視網膜色素上皮細胞hRPE培養條件為：37℃，5% CO2培養箱，用含有10%胎牛血清的低糖DMEM培養，培養液中加入100 μg/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素。細胞分為：對照組、PDGF組、siRNA control+PDGF組、survivin siRNA+PDGF組。PDGF組、siRNA control+PDGF組、survivin siRNA+PDGF組細胞培養時在細胞培養液中加入10 μg/L的PDGF，siRNA control+PDGF組、survivin siRNA+PDGF組細胞分別用轉染siRNA control和survivin siRNA后的hRPE細胞，對照組細胞不做任何處理。細胞轉染的步驟同方法與Lipofectamine 2000轉染試劑說明書相同。首先用qRT-PCR和Western印跡方法測定對照組、PDGF組細胞在培養24 h以后，細胞中survivin mRNA和蛋白水平。再以qRT-PCR和Western印跡方法檢測PDGF組、siRNA control+PDGF組、survivin siRNA+PDGF組細胞培養24 h后細胞中survivin mRNA和蛋白水平，步驟同1.3和1.4。

1.3qRT-PCR檢測人視網膜色素上皮細胞中survivin水平 收集各組細胞，以每107個細胞中加入1 ml的Trizol把各組細胞裂解以后，在裂解液中添加200 μl的三氯甲烷，室溫劇烈震蕩15 s后，靜置10 min。轉移到4℃離心機，以10 000 r/min離心10 min。吸取最上層溶液同異丙醇充分混合以后，離心。將上清溶液吸除掉以后，添加75%的乙醇將RNA沉淀洗滌3次。將RNA置于室溫中，待乙醇全部揮發以后，以焦碳酸二乙酯(DEPC)處理后的水溶解。移液槍吸取約2 μl的RNA以紫外分光光度計檢測濃度和純度。取2 μg的RNA，按照逆轉錄試劑盒合成cDNA后，進行qRT-PCR，PCR為25 μl反應體系，其中包括：cDNA 1 μl、1 μl的10 μmol/L引物、12.5 μl的2×SYBR Green混合物。PCR儀設置程序為：95℃ 30 s，(62℃ 30 s，72℃ 1 min，共40個循環)。β-actin為內參基因，引物為：β-actin-正義鏈5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′，反義鏈5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′。survivin-正義鏈5′-GGAC-CACCGCATCTCTACAT-3′，反義鏈5′-GCAC-TTTGCCAGTTTCC-3′。

1.4Western印跡檢測人視網膜色素上皮細胞中survivin水平 收集各組細胞，在細胞中加入蛋白裂解液，以常規方法提取各組細胞蛋白，并以二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。蛋白樣品在-80℃保存。每個泳道上樣40 μg，在上樣前將蛋白同上樣緩沖液煮沸變性后，加入到上樣孔內，凝膠為：10%的分離膠、5%的濃縮膠。在濃縮膠中電泳電壓為80 V，在分離膠中電泳電壓為100 V。觀察溴酚藍達到凝膠的底部邊緣以后，把電源關閉，終止電泳。取出凝膠，將凝膠上的蛋白轉移到裁剪好的聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，轉膜置于冰上進行，轉膜的電壓調整為90 V。轉膜結束后的PVDF膜用5%牛血清白蛋白置于37℃中封閉2 h以后，再放入含有一抗(1∶400稀釋，4℃過夜)、二抗(1∶2 000稀釋，37℃孵育2 h)的孵育袋中充分結合，用電化學發光(ECL)法化學放光以后，用Bio-Rad采集各組圖像，用Quantity One分析條帶的灰度值，β-actin作為內參，用各目的條帶的灰度值與β-actin灰度值的比值表示目的蛋白水平。

1.5噻唑藍(MTT)檢測人視網膜色素上皮細胞增殖情況 人視網膜色素上皮細胞種植到96孔板內，按照對照組、PDGF組、siRNA control+PDGF組、survivin siRNA+PDGF組方法分組處理，分別在培養24 h、48 h、72 h后，在每個培養板的孔內加入MTT溶液，孵育4 h以后，把上清溶液吸棄掉，添加二甲基亞砜(DMSO)，待結晶物溶解掉以后，將96孔板置于酶標儀上，調整波長為492 nm，測定OD值。

1.6流式細胞術檢測人視網膜色素上皮細胞凋亡情況 各組按照上述方法孵育48 h以后，以磷酸鹽緩沖液(PBS)把各組視網膜色素上皮細胞洗滌2次，在細胞中加入400 μl的結合緩沖液，再分別加入5 μl的膜聯蛋白(Annexin)V-FITC和碘化丙啶(PI)，于室溫中孵育15 min以后，在60 min內以流式細胞儀檢測。各組按照上述方法孵育48 h以后，提取細胞總蛋白，用Western印跡方法測定細胞內Cleaved Caspase-3蛋白水平，步驟同1.4。

1.7JC-1法檢測線粒體膜電位 各組按照上述方法孵育48 h以后，收集細胞，在細胞中加入JC-1染液，置于37℃孵育30 min，以流式細胞儀檢測熒光強度，熒光強度越高，線粒體膜電位越高。

1.8Western印跡檢測胞質中CytC蛋白水平 各組按照上述方法孵育48 h以后，用胞質蛋白提取試劑盒提取胞質中的蛋白，以Western印跡方法測定CytC蛋白水平。步驟同1.4。

1.9統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1PDGF處理后視網膜色素上皮細胞中survivin表達水平 PDGF組survivin mRNA和survivin 蛋白水平均顯著高于對照組(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 Western印跡測定survivin蛋白表達

組別survivin mRNAsurvivin 蛋白對照組1.00±0.000.14±0.04PDGF組3.62±0.250.46±0.03t/P值18.152/0.00011.085/0.000

2.2各組細胞中survivin表達水平 survivin siRNA+PDGF組survivin mRNA和蛋白水平顯著低于PDGF組(P<0.05)。siRNA control+PDGF組survivin mRNA和蛋白水平與PDGF組比較差異沒有統計學意義(P>0.05)。見圖2、表2。

1～3：PDGF組、siRNA control+PDGF組、survivin siRNA+PDGF組圖2 Western印跡測定survivin蛋白表達

組別survivin mRNAsurvivin 蛋白PDGF組1.00±0.000.51±0.06siRNA control+PDGF組1.01±0.130.50±0.08survivin siRNA+PDGF組0.23±0.041)0.17±0.051)F/P值97.411/0.00026.952/0.001

與PDGF組比較：1)P<0.05

2.3各組視網膜色素上皮細胞增殖能力比較 PDGF組視網膜色素上皮細胞OD值明顯高于對照組(P<0.05)。survivin siRNA+PDGF組視網膜色素上皮細胞OD值顯著低于PDGF組(P<0.05)。siRNA control+PDGF組視網膜色素上皮細胞OD值與PDGF組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

2.4各組視網膜色素上皮細胞凋亡率比較 PDGF組細胞凋亡率及Cleaved Caspase-3蛋白水平明顯低于對照組(P<0.05)。survivin siRNA+PDGF組細胞凋亡率及Cleaved Caspase-3蛋白水平顯著高于PDGF組(P<0.05)。siRNA control+PDGF組細胞凋亡率及Cleaved Caspase-3蛋白水平與PDGF組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3、圖4、表4。

2.5各組線粒體膜電位及CytC水平比較 PDGF組線粒體膜電位顯著升高，CytC水平顯著降低，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。survivin siRNA+PDGF組線粒體膜電位顯著降低，CytC水平顯著升高，與PDGF組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。siRNA control+PDGF組線粒體膜電位及CytC蛋白水平與PDGF組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖5、表5。

表3 各組視網膜色素上皮細胞OD值比較

與對照組比較：1)P<0.05；與PDGF組比較：2)P<0.05；表4、5同

1～4:對照組;PDGF組;siRNA control+PDGF組;survivin siRNA+PDGF組；圖5同圖3 Western印跡檢測細胞中Cleaved Caspase-3蛋白水平

圖4 各組流式細胞術檢測結果

表4 各組細胞凋亡率及Cleaved Caspase-3蛋白水平比較

圖5 Western印跡檢測細胞質中CytC蛋白水平

組別線粒體膜電位(熒光值)CytC對照組645.26±34.230.38±0.04PDGF組892.45±31.301)0.14±0.031)siRNA control+PDGF組897.62±21.930.15±0.04survivin siRNA+PDGF組715.46±26.282)0.26±0.042)F/P值58.457/0.00026.579/0.000

3 討 論

PDGF能夠刺激膠質細胞、成纖維細胞、血管平滑肌細胞等多種細胞增生，是一種較強的分裂誘導劑，在單核巨噬細胞、平滑肌細胞、內皮細胞、血小板等中存在，不僅參與組織的生長和發育，還與創傷的愈合、腫瘤等有關〔8～12〕。研究表明，PDGF參與眼科疾病的發生，其可以誘導角膜成纖維細胞增殖、抑制晶狀體上皮細胞生長，可以在體外誘導人視網膜色素上皮細胞增生〔13～15〕。本實驗結果表明，PDGF刺激后的視網膜色素上皮細胞增殖能力升高，說明PDGF誘導視網膜色素上皮細胞增生，與上述研究報道結果一致。

survivin基因位于染色體17q25上，其編碼的蛋白質含桿狀病毒凋亡抑制蛋白重復序列，在這個序列中包括一個Cys-Pro-Thr片段，這個片段將該序列分成兩個部分，在survivin的羧基端有一個α-螺旋motif，參與微管結合過程，這些功能結構域與survivin蛋白的功能密切相關〔16〕。survivin與細胞的生長和凋亡有關，其可以通過Caspase途徑誘導細胞凋亡的發生〔17〕。在心肌細胞、腫瘤細胞、關節炎細胞等多種細胞中已經證實survivin參與調控細胞的增殖和凋亡〔18〕。survivin在增生性玻璃體視網膜病變中表達陽性，參與視網膜色素上皮細胞增殖，下調其表達后可以誘導細胞凋亡，促進細胞增殖〔19〕。本實驗結果顯示，PDGF刺激后的視網膜色素上皮細胞中survivin水平升高，提示survivin可能參與增生性玻璃體視網膜病變發生。

本實驗還通過siRNA技術下調視網膜色素上皮細胞中survivin表達水平，結果發現，survivin沉默后的細胞增殖能力降低，細胞凋亡增多，細胞中Cleaved Caspase-3水平升高，同時線粒體膜電位下降，細胞質中CytC蛋白水平升高，說明下調survivin可以通過線粒體途徑誘導PDGF條件下視網膜色素上皮細胞凋亡，抑制細胞增殖。視網膜色素上皮細胞增生與細胞凋亡異常減少有關，其在PDGF處理后，細胞的增殖速度加快，凋亡減少〔20〕。研究顯示，survivin不僅參與細胞生長過程，還與細胞凋亡有關，沉默其表達后可以誘導腫瘤細胞、視網膜色素上皮細胞凋亡，其作用機制與細胞內Caspase蛋白家族有關〔21,22〕。線粒體途徑是細胞凋亡發生的原因之一，正常情況下，線粒體膜電位在線粒體內外物質交換、滲透壓維持中具有重要作用，而在細胞凋亡發生時，線粒體膜電位下降，使得線粒體內的CytC釋放至胞質中，而CytC可以激活胞質中的Caspase級聯反應誘導細胞凋亡發生〔23～25〕。本實驗證實了沉默survivin可以促進PDGF條件下的視網膜色素上皮細胞凋亡，并且其誘導細胞凋亡機制與線粒體途徑有關。

綜上，PDGF誘導視網膜色素上皮細胞增殖，抑制細胞凋亡，誘導細胞中survivin表達，沉默其表達后可以通過線粒體途徑誘導細胞凋亡發生，抑制細胞的增殖，這為以后研究增生性玻璃體視網膜病變過程中視網膜色素上皮細胞增生的機制奠定了基礎，對于明確增生性玻璃體視網膜病變發生機制具有重要意義。