ATF-4過(guò)表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)從頭合成的影響

任路平 王娜 于賢 劉娜 陳樹春 宋光耀

(河北省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北 石家莊 050000)

隨著非酒精性脂肪肝發(fā)生率逐年升高，其發(fā)病機(jī)制已得到研究者的重視。近年，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)在脂肪肝發(fā)生發(fā)展中的作用已被證實(shí)〔1，2〕，激活轉(zhuǎn)錄因子(ATF)4是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)非折疊蛋白反應(yīng)的下游轉(zhuǎn)錄因子〔3〕，既往研究發(fā)現(xiàn)ATF-4在脂代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用〔4，5〕，但是尚缺少ATF-4對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝直接影響的相關(guān)研究。本研究通過(guò)觀察ATF-4過(guò)表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積及脂質(zhì)從頭合成的影響，探討ATF-4在肝細(xì)胞內(nèi)脂代謝中可能的介導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng) 人肝腫瘤系HepG2細(xì)胞(江蘇省江陰康眾康民生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)。MEM培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)，配比為10%胎牛血清(FBS)+1%非必需氨基酸(NEAA)+1%雙抗+88% MEM培養(yǎng)基。HepG2細(xì)胞貼壁超過(guò)培養(yǎng)瓶底面積80%以上時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。棄去原有培養(yǎng)基，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)(復(fù)溫至室溫)3～5 ml洗滌細(xì)胞2次，加入0.25%的胰蛋白酶消化液1 ml，消化2～3 min后細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變，多角形貼壁細(xì)胞近乎縮成圓形，胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間出現(xiàn)縫隙，此時(shí)加入1 ml新鮮MEM培養(yǎng)基(復(fù)溫至室溫)終止消化。經(jīng)吹打混勻后得到細(xì)胞懸液，接種到新的培養(yǎng)瓶中，按1∶2或1∶3比例進(jìn)行傳代，加新鮮培養(yǎng)基至5 ml，放置于5% CO2、37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 制備DNA-Lipofectamine 2000復(fù)合物:①用50 μl無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋DNA(0.8 g)，輕輕混勻；②Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)使用前輕輕混勻，用48 μl無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋2 μl Lipofectamine 2000，輕輕混勻，室溫孵育5 min；③將①+②的液體加在一起，輕輕混勻，室溫孵育20 min，形成DNA-Lipofectamine 2000復(fù)合物；④將100 μl DNA-Lipofectamine 2000復(fù)合物加入培養(yǎng)板中，輕輕前后搖勻；⑤放入37℃孵箱中培養(yǎng)24～48 h，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后收集細(xì)胞，用于轉(zhuǎn)染目的蛋白的測(cè)定。

1.3細(xì)胞分組 根據(jù)不同處理方法將細(xì)胞進(jìn)行分組：未轉(zhuǎn)染組(普通培養(yǎng)基)，陰性對(duì)照組(普通培養(yǎng)基+轉(zhuǎn)染空白對(duì)照質(zhì)粒)及 ATF-4上調(diào)組(ATF-4+組，普通培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2細(xì)胞+轉(zhuǎn)染針對(duì)上調(diào)ATF-4質(zhì)粒)。

1.4HepG2細(xì)胞三酰甘油測(cè)定 將各組培養(yǎng)后的HepG2細(xì)胞懸液離心 10 min(1 000 r/min)，留細(xì)胞沉淀，以GPO-PAP法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)三酰甘油含量。

1.5HepG2細(xì)胞油紅O染色 應(yīng)用10%中性甲醛固定細(xì)胞，去離子水稀釋油紅儲(chǔ)存液，染色2 h，沖洗染液后照相。

1.6基因測(cè)定 Trizol法提取總RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(RT-PCR)測(cè)定肝細(xì)胞內(nèi)脂代謝相關(guān)基因的mRNA表達(dá)，包括固醇調(diào)節(jié)元素結(jié)合蛋白(SREBP)-1c、脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)和硬酯酰輔酶A去飽和酶(SCD)-1。引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 脂代謝相關(guān)酶的基因檢測(cè)引物序列

1.7蛋白表達(dá)測(cè)定 HepG2細(xì)胞蛋白經(jīng)提取后采用BCA法定量，應(yīng)用Western印跡方法測(cè)定蛋白。蛋白經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳完成后，參照蛋白Marker分離條帶，切下含目的蛋白的凝膠，β-actin分子量43 kD，SCD-1、ACC，F(xiàn)AS分子量分別為37、288、48 kD。將聚偏氟乙烯(PVDF)膜切成與凝膠同等大小，轉(zhuǎn)膜、封閉后加入抗體(1∶1 000～2 000稀釋)，洗膜后加入二抗(1∶10 000 稀釋)孵育。化學(xué)發(fā)光，顯影，定影。將定影后的X線膠片于凝膠成像系統(tǒng)成像，UVP軟件進(jìn)行分析。結(jié)果用目的蛋白條帶的IOD值與β-actin條帶的IOD值的比值表示。FAS抗體：Santa Cruz公司，ATF-4、SCD-1和ACC抗體：Cell Signal公司，β-actin抗體：SAB公司。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.0軟件，行完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1轉(zhuǎn)染ATF-4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)ATF-4的影響 ATF-4+組ATF-4的表達(dá)水平(2.35±0.31)比未轉(zhuǎn)染組(1.00±0.12)、陰性對(duì)照組(1.11±0.19)明顯升高(均P<0.01)，見(jiàn)圖1。

2.2轉(zhuǎn)染ATF-4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響 與未轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染ATF-4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞TG含量升高40%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔未轉(zhuǎn)染組(2.31±0.39)μmol/g,陰性對(duì)照組(2.43±0.21)μmol/g,ATF4+組(3.36±0.45)μmol/g，P<0.01〕，油紅O染色示脂滴亦顯著增多，見(jiàn)圖2。

2.3轉(zhuǎn)染ATF-4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)脂質(zhì)從頭合成相關(guān)因子基因表達(dá)的影響 與未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組相比，ATF-4+組SREBP-1c基因表達(dá)明顯增加(P<0.01)，ACC、FAS、SCD-1基因表達(dá)明顯增加(均P<0.05)，見(jiàn)表2。

圖1 轉(zhuǎn)染ATF-4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后ATF-4蛋白表達(dá)變化

圖2 轉(zhuǎn)染ATF-4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響(×400)

組別SREBP-1cACCFASSCD-1未轉(zhuǎn)染組1.00±0.091.00±0.141.00±0.211.00±0.25陰性對(duì)照組1.03±0.111.12±0.231.05±0.091.16±0.09ATF4+組2.47±0.391)2.69±0.432)2.07±0.202)3.12±0.512)

與未轉(zhuǎn)染組及陰性對(duì)照組比較：1)P<0.01,2)P<0.05

2.4轉(zhuǎn)染ATF-4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)脂質(zhì)從頭合成相關(guān)因子蛋白表達(dá)的影響 與未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組相比，ATF-4+組的ACC、FAS、SCD-1的蛋白表達(dá)顯著增加(ACC蛋白表達(dá)：未轉(zhuǎn)染組1.00±0.08，陰性對(duì)照組0.98±0.09，ATF4+組1.21±0.11；FAS蛋白表達(dá)：未轉(zhuǎn)染組1.00±0.07，陰性對(duì)照組0.96±0.13，ATF4+組1.26±0.14；SCD-1蛋白表達(dá)：未轉(zhuǎn)染組1.00±0.21，陰性對(duì)照組1.04±0.16，ATF4+組1.35±0.16；均P<0.05),見(jiàn)圖3。

圖3 轉(zhuǎn)染ATF-4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)ACC，F(xiàn)AS，SCD-1蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

本課題組前期研究表明，ERS參與肝臟脂質(zhì)沉積的介導(dǎo)作用〔6，7〕。ATF-4是ERS非折疊蛋白反應(yīng)通路之一磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(PERK)-真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄起始因子α亞單位(eIF-2α)-ATF-4通路的下游轉(zhuǎn)錄因子〔8〕，是基本亮氨酸拉鏈蛋白家族之一，屬于環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)家族〔9〕。ATF-4在很多組織包括大腦、心臟、脂肪組織和肝臟等中均有表達(dá)。既往研究表明，高脂、高果糖喂養(yǎng)小鼠誘導(dǎo)脂肪肝后，肝內(nèi)均存在PERK/eIF-2α/ATF-4通路激活〔10〕。而近年也有研究表明ATF-4可能對(duì)脂代謝具有調(diào)節(jié)作用，并參與到非酒精性脂肪肝的發(fā)生發(fā)展中〔11〕。一個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠模型表明PERK/eIF-2α/ATF-4通路在肝臟脂質(zhì)合成的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，ATF-4基因敲除可改善高果糖喂養(yǎng)小鼠誘導(dǎo)的高脂血癥〔12〕。研究表明，ATF-4缺失的小鼠可抵抗高脂喂養(yǎng)誘導(dǎo)的肥胖及肝臟脂質(zhì)沉積〔13〕。但是目前尚缺少ATF-4基因表達(dá)變化對(duì)肝臟脂質(zhì)從頭合成直接影響的細(xì)胞研究。本實(shí)驗(yàn)將HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染了過(guò)表達(dá)的ATF-4的質(zhì)粒后，結(jié)果表明ATF-4基因特異性的變化在肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積中發(fā)揮重要作用，證實(shí)了PERK-eIF2α-ATF-4通路在調(diào)控ERS誘導(dǎo)細(xì)胞脂質(zhì)沉積中的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，ATF4過(guò)表達(dá)可促進(jìn)SREBP-1c的基因表達(dá)。SREBP-1c是調(diào)節(jié)脂質(zhì)從頭合成的一個(gè)關(guān)鍵上游調(diào)控因子，并與肝細(xì)胞ERS相關(guān)〔14，15〕，而ACC、FAS和SCD-1是脂質(zhì)從頭合成下游的關(guān)鍵酶。有研究應(yīng)用ERS誘導(dǎo)劑Tg培養(yǎng)HepG2和LO2細(xì)胞后引起ERS及細(xì)胞內(nèi)三酰甘油含量增多，同時(shí)伴有SREBP-1c、ACC1、FAS的表達(dá)增加，而加用SREBP-1c抑制劑4-(2-氨乙基) 苯磺酰氟化物(AEBSF)后，細(xì)胞脂質(zhì)沉積得以改善，ACC1和FAS水平降低，證實(shí)了SREBP-1c在肝細(xì)胞內(nèi)對(duì)脂質(zhì)從頭合成的上游調(diào)節(jié)作用及其與ERS的相關(guān)性〔16〕。以往已有研究發(fā)現(xiàn)PERK-eIF2α-ATF-4通路中的PERK可通過(guò)SREBP-1影響脂質(zhì)從頭合成，小鼠PERK基因敲除后減少了脂質(zhì)合成上游調(diào)控因子SREBP-1基因表達(dá)水平〔17〕。本研究證實(shí)了PERK-eIF2α-ATF-4通路的下游轉(zhuǎn)錄因子ATF-4可直接刺激SREBP-1c的基因合成，并進(jìn)而促進(jìn)下游脂質(zhì)從頭合成關(guān)鍵酶ACC、FAS和SCD-1的基因和蛋白表達(dá)，從而刺激脂質(zhì)從頭合成。ATF-4刺激脂質(zhì)從頭合成是其引起肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的重要機(jī)制之一。ATF-4作用于SREBP可能的機(jī)制是由于ATF-4缺失導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白合成減少，抑制了雷帕霉素的哺乳動(dòng)物靶點(diǎn)(mTOR)通路，抑制了核糖體S6蛋白激酶(S6K)作用，減少脂肪從頭合成〔18〕。

ERS通路具有非常的復(fù)雜性和非專一性，細(xì)胞內(nèi)具有復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，而通路中的各個(gè)轉(zhuǎn)錄因子又具有廣泛的生理作用。ATF-4也具有廣泛的生理作用，有研究表明ATF-4可以間接調(diào)節(jié)糖脂代謝，ATF-4可以通過(guò)對(duì)其他轉(zhuǎn)錄因子的影響促進(jìn)脂肪因子分泌及胰島素敏感性受損〔19，20〕。

總之，上調(diào)HepG2細(xì)胞ATF-4后，可以引起三酰甘油沉積，其機(jī)制與ATF-4過(guò)表達(dá)引起脂質(zhì)從頭合成上游因子SREBP-1c和下游酶類ACC、FAS、SCD-1的表達(dá)增加有關(guān)。本研究結(jié)果證實(shí)ATF-4可能介導(dǎo)了非酒精性脂肪肝的發(fā)生發(fā)展，具體的分子機(jī)制尚需深入研究。