柚皮素聯合Bcl-2抑制劑ABT-263調控信號通路AKT對胃癌細胞增殖凋亡的影響

葉群立 張洋洋 羅金健

(鄭州大學附屬鄭州中心醫院 1急診科，河南 鄭州 450000；2消化內科)

柚皮素(Nar)是一種廣泛存在于西紅柿、葡萄和枳實等蕓香科植物中的黃酮類化合物。研究表明，Nar對乳腺癌、胃癌、肺腺癌等多種腫瘤〔1～6〕的發生發展具有很好的抑制作用。ABT-263是一種BH3類似物的Bcl-2抑制劑〔7〕，對乳腺癌〔8〕、肝癌〔9〕和肺癌〔10〕等具有很好的抗腫瘤作用，然而在胃癌細胞中的作用未見報道。本實驗通過Nar和ABT-263的聯合用藥，探討其對胃癌細胞增殖凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 人胃癌細胞株SGC7901購于上海慧穎生物科技有限公司；Nar、ABT-263、噻唑藍(MTT)檢測試劑盒、胎牛血清和RPMI1640培養基均購于美國Sigma公司；Western印跡所用試劑均購自上海Bio-Rad公司，β-actin(內參)單克隆抗體、蛋白激酶B(AKT)及磷酸化(p)-AKT多克隆抗體均購自上海Santa Cruz公司。酶標儀和恒溫CO2培養箱分別來自美國Dynex technologies公司和美國Thermo公司，流式細胞儀和膜聯蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)試劑盒均購自南京凱基生物公司。

1.2細胞培養 將人胃癌細胞株SGC7901培養在RPMI-1640培養液(含有10%的胎牛血清，1%的谷氨谷氨酰胺及抗生素)中，細胞密度調整為1×104個/ml，在37℃，5% CO2飽和濕度的培養箱中培養2 d，0.25%胰酶消化傳代，取對數生長期細胞用于實驗。

1.3MTT法檢測細胞增殖抑制作用 取經胰酶消化處理的上述對數期生長的細胞，制備SGC-7901細胞懸液，按照1×104個/孔接種于96孔培養板中，培養24 h后分別加入處理液Nar和ABT-263抑制劑，Nar組濃度分別為 0、30、60、90、120 μmol/L，ABT-263組濃度依次為 0、5、10、15、20 μmol/L，均以0 μmol/L為對照組；同時以60 μmol/L Nar+5 μmol/L ABT-263抑制劑為聯合用藥組，在常規條件下依次培養24、48、72 h后，加入5 mg/ml MTT溶液，4 h后采用酶標儀在450 nm波長下測其吸光值(A)，根據公式計算增殖抑制率(%) =1-A處理組/A對照組×100%。各濃度設3個復孔，每個處理重復3次。

1.4流式細胞儀檢測細胞凋亡 將濃度為5×105個/ml生長期細胞接種于6孔板中，共設4組，分別為對照組、Nar組、ABT-263組及聯合用藥組，其中Nar濃度為60 μmol/L，ABT-263的濃度為5 μmol/L。培養24 h，待完全貼壁后，向各處理組中加入藥物處理48 h后，用0.25 %的胰酶消化細胞，離心，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，加入5 ml RPMI-1640培養基制成細胞懸液。取100 μl細胞懸液各加入5 μl Annexin V-FITC和PI，避光處理10 min，流式細胞儀法上機檢測凋亡率。每組實驗均重復3次。

1.5Western印跡檢測AKT相關蛋白的表達 收集1.4中藥物處理48 h后的各組細胞，PBS洗滌后，加入細胞裂解液，放置15 min，低溫高速離心，吸取上清液，用紫外分光光度計測量蛋白濃度。取各組等量的蛋白，加入緩沖液搖勻，進行10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。采用半干轉法轉到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，封閉1 h后將膜與AKT、p-AKT一抗(1:200)置于4℃孵育過夜。加入二抗(1∶1 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜，使用Western曝光儀顯影，并用灰度分析軟件Quantity One v4.62進行分析蛋白表達強度。

1.6統計學方法 采用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析及LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1Nar和ABT-263對SGC7901細胞增殖的抑制作用 隨Nar作用濃度增大及作用時間延長，對SGC7901細胞的增殖抑制率均顯著增加(P<0.05)，見表1。隨ABT-263作用濃度增大及作用時間延長，對SGC7901細胞的增殖抑制率均顯著增加(P<0.05)，見表2。與對照組比較，Nar組、ABT-263組及聯合用藥組細胞的增殖抑制率均顯著增加(P<0.05)；與Nar組和ABT-263組比較，聯合用藥組細胞的增殖抑制率均顯著增加(P<0.05)。見表3、圖1。

表1 不同濃度Nar作用下不同培養時間SGC7901細胞增殖抑制率的比較

同一時間與前一濃度比較：1)P<0.05;同一濃度與前一時間比較：2)P<0.05;表2同

表2 不同濃度ABT-263作用下不同培養時間SGC7901細胞增殖抑制率的比較

表3 不同培養時間各組SGC7901細胞增殖抑制率比較

與對照組比較：1)P<0.05;與聯合用藥組比較：2)P<0.05;表4同

圖1 Nar和APG-1252處理48 h的細胞凋亡圖

2.2各組細胞凋亡率比較 Nar組〔(29.58±2.10)%〕和ABT-263組細胞凋亡率〔(15.82±1.02)%〕均較對照組顯著升高〔(5.65±0.13)%，P<0.05〕，聯合用藥組凋亡率〔(58.32±3.45)%〕顯著高于Nar組及ABT-263組(P<0.05)。見圖1。

2.3各組AKT相關蛋白的表達 與對照組比較，Nar組、ABT-263組及聯合用藥組p-AKT蛋白表達均顯著降低(P<0.05)；與Nar組和ABT-263組比較，聯合用藥組p-AKT蛋白表達顯著降低(P<0.05)。各組AKT蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。見表4、圖2。

表4 各組AKL、p-AKT蛋白表達比較

1：對照組；2：Nar組；3：APG-1252組；4：聯合用藥組圖2 信號通路AKT相關蛋白的表達

3 討 論

胃癌的發生在早期并不易被察覺也沒有特異性癥狀，一旦發現就診時多為晚期。隨著老齡化的加劇，癌癥的防止和治療也越來越迫切〔11，12〕。研究發現，青年人中胃癌的發病率逐漸上升〔13〕，Nar是一種油皮苷的苷元，具有廣泛的抗菌、抗癌、抗腫瘤等藥理活性，由于其本身水溶性、脂溶性特點的限制對其研究還處在臨床應用上。隨著科學技術的發展，近年來在胃癌方面的基礎研究也取得了顯著的進展，中藥、西藥和抗腫瘤抑制劑間相互聯合用藥的研究〔14～18〕已成為研究的熱點。

研究發現，Nar可通過抑制磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/AKT通路中PI3K活性、降低含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-31的活性來促進乳腺癌的凋亡〔4〕；阻斷細胞周期并調節AKT及核因子(NF)-κB信號通路抑制乳腺癌細胞的增殖〔19〕；通過下調基質金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9表達抑制胃癌細胞的增殖和侵襲〔20〕。ABT-263作為Bcl-2抑制劑的第二代可口服的抗腫瘤藥物，在臨床試驗中對多種癌癥的治療效果非常優異〔21〕，與髓細胞白血病基因(MCL)-1不表達或微弱表達關系密切。

本實驗的結果顯示：經Nar或ABT-263的不同濃度和不同作用時間處理的SGC7901細胞均顯示增殖抑制作用，且呈劑量-時間依賴性。聯合用藥后表現出協同作用。兩藥聯用后的細胞凋亡率高于Nar或ABT-263單用。Nar聯合ABT-263處理48 h的AKT信號通路相關蛋白的表達，與Nar、ABT-263單用相比，p-AKT表達水平進一步下降，而AKT表達受影響不明顯。研究說明，Nar和ABT-263均可通過下調p-AKT抑制AKT信號通路，進一步達到抗癌的作用。

綜上，Nar和ABT-263對胃癌細胞均有增殖抑制作用和凋亡促進作用，同時兩者聯用具有一定的協同增效的作用，且其作用與下調p-AKT抑制AKT信號通路有關。