利用高內(nèi)涵篩選顯微鏡技術(shù)評估培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞衰老程度

劉佳 李鋼 周婷婷 陳丹娜

(1長沙醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，湖南 長沙 410219；2長沙市第四醫(yī)院血液科)

間充質(zhì)干細胞(MSCs)是來源于中胚層的非造血干細胞，主要取材于骨髓，現(xiàn)在也在開發(fā)臍血、脂肪組織等來源，其有著較好的自我更新能力、多向分化能力及低免疫源性，在自身免疫性疾病和移植物抗宿主病(GVHD)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、泌尿系統(tǒng)疾病、肝疾病、運動系統(tǒng)疾病等方面都有廣泛的應用前景。衰老過程影響MSCs的功能，導致分化能力和免疫抑制力的降低，這恰巧是MSCs在細胞治療中的主要價值〔2〕。用于臨床治療使用的細胞必須評估衰老，以保障醫(yī)療安全。目前，有多種方法可用于評估衰老，但多數(shù)方法過于繁瑣。本研究主要探討高內(nèi)涵篩選顯微鏡技術(shù)對于培養(yǎng)中的MSCs衰老評估的有效性。

1 材料與方法

1.1主要試劑盒和儀器 人骨髓MSCs分離試劑盒購自天津灝洋TBD公司，端粒長度測定試劑盒購自瑞士羅氏公司，組織樣本DNA提取純化試劑盒購自美國Qiagen公司，SA-β-gal檢測試劑盒購自美國Biolabs公司。高內(nèi)涵篩選顯微鏡購自美國Thermo公司，在北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司進行細胞拍攝。

1.2MSCs來源 MSCs是4名健康成人志愿者在簽訂知情同意書后，在長沙第四醫(yī)院血液科無菌室從其髂嵴處抽取骨髓分離。捐贈者匿名，年齡為23～36歲，男女各半，編碼S1～S4。實驗方案得到長沙醫(yī)學院和長沙市第四醫(yī)院倫理委員會批準。

1.3實驗方法

1.3.1骨髓MSCs的獲取、鑒定和培養(yǎng) 從抽取的骨髓中利用試劑盒分離MSCs，從原代開始連續(xù)培養(yǎng)到衰老，傳代數(shù)用p表示。MSCs以低糖DMEM(含10%胎牛血清和雙抗)進行培養(yǎng)。MSCs鑒定根據(jù)國際細胞治療協(xié)會(ISCT)指南〔3〕進行，通過流式細胞儀鑒定細胞表面抗原，通過von Kossa染色和蘇丹Ⅲ染色進行成骨和脂肪分化分析〔4〕；在培養(yǎng)過程中，用倒置顯微鏡進行細胞觀察。當達到80%的匯合時，細胞通過胰蛋白酶消化，以1×104/ml的密度進行傳代，直至衰老。在第2、4、6和8代(表示為p2、p4、p6、p8)收集細胞進行分析。

1.3.2圖像分析的樣本準備、采集和分析 p2、p4、p6、p8細胞在6孔板以1×104/ml密度接種，在48 h的附著和增殖后，細胞以4%多聚甲醛固定，0.1%Triton X-100處理后，以1 μg/ml Mask Deep Red染色細胞質(zhì)，以0.125 μg/ml DAPI染色細胞核。細胞核和細胞質(zhì)的圖像是在385 nm和630 nm處分別采集信號形成的。細胞拍攝時選取6孔板中間部分，當1個目標只包含1個細胞核且細胞輪廓完全出現(xiàn)在拍攝視野中時，被認為是一個符合要求的細胞。符合標準的以綠線界定細胞輪廓，不符合標準的用紫紅線界定。每個樣本中分析3次并取均值，以校正數(shù)據(jù)。所得到的圖像是用高內(nèi)涵篩選顯微鏡配套的Thermo Scientific軟件進行面積計算。

1.3.3端粒長度的Southern印跡分析 端粒長度是通過對末端限制片段(TRFs)的Southern印跡分析來測定的。利用組織樣本試劑盒分離并純化基因組DNA。端粒長度分析是用端粒長度測定試劑盒來進行的：先用HinfI和RsaI消化2 μg基因組DNA，電泳分離。分離后的DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜，紫外交聯(lián)儀進行交聯(lián)。用地高辛(DIG)標記的端粒特異性探針(TTAGGG)進行12 h雜交，加入抗DIG抗體后放射自顯影，利用ImageJ分析軟件計算端粒長度。每個樣本測定3次，以均值作圖。

1.3.4衰老相關的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性檢測 SA-β-gal活性用細胞衰老檢測試劑盒來測定。首先破裂細胞膜，收集細胞內(nèi)蛋白質(zhì)，熒光標記SA-β-gal，以等量的總蛋白質(zhì)進行檢測。熒光信號在360 nm處激發(fā)，465 nm讀取，結(jié)果表示為相對熒光單位(RFU)。每個樣本檢測3次，以均值作圖。

1.3.5統(tǒng)計學方法 使用SPSS10.0軟件進行方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1不同代的MSCs細胞形態(tài) 細胞衰老的判定標準為經(jīng)過14 d的培養(yǎng)，細胞匯合依然低于30%，細胞呈現(xiàn)大而扁平或不規(guī)則的形態(tài)，顆粒數(shù)量激增。S1～S4 4個樣本細胞從原代培養(yǎng)至衰老平均為9代，培養(yǎng)時間為(95±17)d。高內(nèi)涵篩選顯微鏡成像后可以發(fā)現(xiàn)，在原代至p4，細胞小、呈現(xiàn)紡錘形，4個樣本的細胞接種2 d后都處于對數(shù)生長期，培養(yǎng)時間為6～8 d。p5、p6開始，細胞生長速度緩慢降低，每一代時間為9～11 d。p8～p10，多數(shù)細胞停止了增殖，顯示了衰老細胞的典型特征，如大尺寸、不規(guī)則形狀和顆粒度(圖1)。其中樣本S3進入衰老最早，p8細胞經(jīng)過14 d培養(yǎng)，匯合比率始終無法達到30%。

圖1 高內(nèi)涵篩選顯微鏡下各代細胞的圖像分析(×100)

2.2細胞面積的增加 p2 MSCs細胞面積小，形態(tài)并不很一致。p4時各樣本面積略增，均一性好。p6細胞形態(tài)開始不規(guī)則，面積增大。p8多數(shù)細胞面積顯著增大，也有少量小細胞，p2、p4、p6、p8細胞大小呈現(xiàn)逐步顯著增大趨勢(P<0.05)。見表1。考慮到細胞匯合作為傳代指標，細胞尺寸的增加側(cè)面反映了傳代晚期各組細胞數(shù)目的減少，培養(yǎng)時間延長則提示細胞增殖能力下降。

2.3衰老標記物的表達 隨著MSCs培養(yǎng)時間延長，端粒逐漸縮短，p2、p4、p6、p8端粒長度差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。p2、p4、p6、p8細胞SA-β-gal活性呈現(xiàn)逐步顯著增加趨勢(均P<0.05)。見表1。

表1 不同細胞代數(shù)細胞面積、端粒長度、SA-β-gal活性比較

與p2比較：1)P<0.05；與p4比較：2)P<0.05；與p6比較：3)P<0.05

3 討 論

MSCs是一種多效的基質(zhì)細胞群，可從骨髓、脂肪組織、臍血等多種來源中分離出來，有分化為成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞等多種細胞的能力，被歸類為多功能干細胞〔5〕，可以用于各種組織再生〔6〕。除了多向分化能力外，MSCs也有很強的免疫抑制潛力，因此被用于GVHD〔7〕，對免疫性疾病可能也有效果。國際細胞治療協(xié)會對MSCs鑒定標準是貼壁的成纖維細胞樣細胞，表達特異性表面抗原，缺乏造血標志物，并能分化為成骨細胞和脂肪細胞。現(xiàn)在用于臨床的細胞治療MSCs通常是從抽取的骨髓中分離的，有效成分是其中的微量的單核細胞部分。而臨床治療需要大量的細胞，MSCs勢必要在體外擴增來滿足需要〔8〕。擴增時，復制性衰老開始啟動。MSCs應屬于有限生命周期的細胞，培養(yǎng)的MSCs會逐漸衰老，導致細胞分裂永久地停滯，雖然細胞在一段時間內(nèi)仍然存活，但已經(jīng)失去產(chǎn)生后代的能力了〔9〕。衰老可能危害用于臨床治療的產(chǎn)品質(zhì)量和安全性。對衰老程度準確評估，可以檢測衰老相關的DNA甲基化變化來評估細胞產(chǎn)品，但方法很煩瑣〔10〕。如果能找到一個節(jié)省人力和成本效益的方式，在MSCs進行培養(yǎng)可即時判斷，無疑可以更全面的監(jiān)測MSCs質(zhì)量。

監(jiān)測細胞形態(tài)變化是可以作為保障MSCs生產(chǎn)的重要手段。端粒隨著細胞分裂而縮短，反映細胞和機體的生物學年齡。當細胞最短的端粒達到其臨界最小長度時，就會觸發(fā)衰老〔11〕。除了端粒縮短，衰老也伴隨著細胞的SA-β-gal增加〔12〕。本研究確定了細胞形態(tài)、面積變化和衰老的聯(lián)系，其中最容易觀察到的細胞衰老的指標是細胞大小和形態(tài)的變化，年輕的細胞多呈現(xiàn)小的紡錘形，衰老細胞則是大而不規(guī)則形狀。本研究利用高內(nèi)涵篩選顯微鏡對細胞面積進行精確計算，這是一種高效自動熒光圖像采集和定量分析的篩選系統(tǒng)。檢測發(fā)現(xiàn)p2、p4細胞小且均勻，平均細胞面積及其變異在p6后迅速增加。與此同時，SA-β-gal表達顯著增加，端粒顯著縮短。綜合分析細胞面積與兩個衰老標記物之間的相關性，發(fā)現(xiàn)細胞面積和端粒長度大致呈負相關性，細胞面積和SA-β-gal活性有著很強的正相關性，因此細胞面積也可作為衰老檢測的一個顯著指標。衰老引起的面積增加可以很容易檢測到，而且重復性好，有利于將這一無創(chuàng)的顯微技術(shù)用于常規(guī)的干細胞生產(chǎn)中，來判定培養(yǎng)的細胞衰老情況。

本研究觀察到樣本S3的細胞面積在早期就有明顯增加，與其他細胞樣本相比，S3的端粒開始就更短，SA-β-gal表達就更顯著。這很可能與捐贈年齡有關：其他捐贈者年齡23～29歲，而供體S3為36歲。供者年齡高導致這樣的現(xiàn)象，其他研究也得出了類似的結(jié)果〔13，14〕。本研究表明，細胞面積的增加確實可以作為MSCs培養(yǎng)中判定衰老的有效指標。Whitfield等〔15〕利用篩選顯微鏡來分析培養(yǎng)中的MSCs變化，在6 d的時間里連續(xù)不斷地記錄MSCs變化，將大于7 000 μm2定義為大細胞，并發(fā)現(xiàn)所有這些細胞都是SA-β-gal陽性。這從側(cè)面證實了本研究。