甲狀腺素對大鼠海馬細胞凋亡和AMPA、NMDA受體的影響

謝奇偉 方紳哲 唐文昱 施晨潔 趙晶 韋登明

(寧波大學醫學院病理學系，浙江 寧波 315211)

甲狀腺功能亢進癥(甲亢)是由于過多的甲狀腺激素釋放導致心臟、肌肉、大腦等多器官的損傷的疾病，其可導致機體的學習記憶力減弱，但具體機制尚不清楚〔1〕。研究表明〔2～4〕，機體的學習記憶的改變與海馬細胞的凋亡及谷氨酸受體〔α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(AMPA)和N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)〕表達變化有關。但目前國內外尚未見甲亢導致的機體學習記憶力降低是否與海馬細胞的凋亡及AMPA受體和NMDA受體表達變化有關的報道。本研究在建立甲亢大鼠模型基礎上，旨在研究甲狀腺素對大鼠海馬細胞凋亡和AMPA、NMDA受體的影響。

1 材料和方法

1.1實驗材料 健康清潔級SD大鼠20只由寧波大學實驗動物中心代購于浙江省動物中心，合格證號0102016，體重(200±10)g，雄性。隨機分為對照組、甲亢組，每組各10只。兔抗鼠Bax、Bcl-2多克隆抗體(博士德生物有限公司)；兔抗鼠AMPA、NMDA抗體(博士德生物有限公司)；L-甲狀腺素粉劑和羧甲基纖維素鈉(美國Sigma公司)；山羊抗兔Ⅱ抗(中杉金橋有限公司)。BM-Ⅶ包埋機(宏業醫用儀器公司)；HM-325石蠟切片機(德國LEICA公司)；CX40生物顯微鏡(日本Olympus公司)；JD801形態學圖像分析系統(江蘇捷達科技發展有限公司)；RM6240生物信號采集系統。

1.2動物模型的建立 模型參照文獻方法〔5，6〕并進行改良后建立。將L-甲狀腺素0.1 g/L混懸于5 g/L羧甲基纖維素鈉中，置于冰箱保存待用，使用前充分搖勻。甲亢組大鼠每天腹腔注射L-甲狀腺素0.5 mg/kg連續35 d，對照組腹腔注射等體積的羧甲基纖維素鈉溶液。大鼠均喂常規固體飼料及瓶裝飲用水。

1.3標本采用與制取 L-甲狀腺素腹腔注射給藥35 d，成功制備甲亢大鼠模型。將大鼠用水合氯醛麻醉后，開顱取含有海馬的腦組織塊置10%甲醛中，固定、脫水、浸蠟、包埋后制成石蠟切片。進行 HE染色和免疫組織化學染色。

1.4血清三碘甲腺原氨酸(T3)、血清總甲狀腺素(T4)含量的檢測 提取大鼠心血5 ml，用放射免疫分析法測定血清中T3、T4含量，實驗方法嚴格按照說明書操作。

1.5Morris水迷宮檢測 采用Morris水迷宮試驗〔7〕：(1)定位航行：連續5 d早晨將大鼠各從2個入水點面向池壁放入水中，記下大鼠在90 s內游上平臺的時間(即逃避潛伏期)，通過它來檢測其學習力；(2)空間探索：第6天拆除平臺，將其各從2個入水點面向池壁放入水中，記錄大鼠90 s時間內在平臺所在象限的總共停留時間。

1.6免疫組化檢測Bax、Bcl-2蛋白、AMPA、NMDA受體的表達 石蠟切片常規脫蠟，在3%過氧化氫(H2O2)中室溫孵育，0.01 mmol/L枸櫞酸溶液高溫抗原修復，使用正常山羊血清封閉，滴加抗Bax(1∶50)、Bcl-2(1∶50)、AMPA(1∶400)、NMDA(1∶400)抗體免疫組化染色，置于濕盒中4℃冰箱環境過夜。滴加二抗，進行鏈霉親和素-生物復合物(SABC)反應和二氨基聯苯胺(DAB)顯色。蘇木素復染脫水透明封片。在400倍光鏡下，每張切片在海馬CA1區隨機選取5個視野進行檢測〔8〕，分別計算Bax、Bcl-2和AMPA、NMDA受體平均積分光密度。

1.7統計學處理 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1兩組血清T3、T4水平比較 與對照組比較，甲亢組血清T3、T4水平明顯升高(P<0.01)。見表1。

表1 兩組血清T3、T4水平比較

與對照組比較：1)P<0.01；表3同

2.2兩組逃避潛伏期比較 隨著訓練天數的增加，各組大鼠的平臺潛伏期明顯縮短(P<0.05)。與對照組比較，第3～5天甲亢組逃避潛伏期明顯增加(P<0.05)。見表2。

表2 兩組逃避潛伏期

與對照組比較：1)P<0.05；組內與前一時間點比較：2)P<0.05

2.3兩組海馬Bax、Bcl-2、AMPA、NMDA受體的表達 與對照組比較，甲亢組海馬Bax蛋白表達明顯增高(P<0.01)；Bcl-2蛋白及AMPA受體和NMDA受體的表達明顯降低(P<0.01)。見表3、圖1。

表3 兩組Bax、Bcl-2蛋白及AMPA、NMDA受體表達

圖1 海馬Bax、Bcl-2蛋白及AMPA、NMDA受體的表達(免疫組化，×400)

3 討 論

Bcl-2家族是細胞內凋亡調控常用的凋亡表達基因，包括Bcl-2基因和Bax基因。研究表明〔9～12〕，Bax、Bcl-2 蛋白的表達和兩者之間的比例關系是決定細胞凋亡的關鍵因素。Bcl-2蛋白可以通過調節Ca2+濃度、降低細胞膜通透性、減少細胞色素C的釋放，起到抑制細胞凋亡的作用。而Bax 基因對Bcl-2 具有拮抗作用，它編碼的Bax蛋白可與Bcl-2形成異二聚體。本研究結果表明，甲亢大鼠在學習記憶方面有明顯的減弱；長期高濃度的甲狀腺素可能通過增加Bax蛋白的表達，減少Bcl-2蛋白的表達促進細胞凋亡從而導致記憶力降低。

研究表明〔12～15〕，長時程增強(LTP)和長時程抑制是海馬正常工作的基礎。它依賴于AMPA受體和NMDA受體的表達。高頻刺激使突觸前膜釋放的谷氨酸遞質，與突觸后膜上的AMPA受體結合使突觸后膜去極化。突觸后膜去極化達到一定程度后，NMDA受體通道內的Mg2+移開，使 Ca2+內流，觸發一系列生化反應，導致LTP的產生。本研究結果提示長期高濃度的甲狀腺素可能通過減少AMPA受體和NMDA受體的表達從而導致記憶力降低。