p62和Ki-67在乳腺浸潤性導管癌中的表達及意義

程新宇 周成美 孫潔 王翠芳

(1沈陽醫學院附屬中心醫院病理科，遼寧 沈陽 110024；2錦州醫科大學)

自噬相關蛋白p62由C-Myc編碼，是在細胞質中合成、定位于細胞核的一種多功能泛素化結合蛋白〔1〕，具有選擇性自噬功能，可在一定程度上反映自噬活性〔2〕。近年來隨著研究的不斷深入，研究者發現p62參與了包括自噬在內的眾多生命活動信號通路〔3〕，其表達和調控異常與多種惡性腫瘤密切相關〔4〕；增殖指數(Ki-67)是細胞增殖的重要標志，常可作為預測惡性腫瘤發展及預后的指標。本文主要探討p62和Ki-67表達與乳腺浸潤性導管癌患者臨床病理特征的關系，為乳腺癌治療及預后提供新的研究靶點。

1 材料與方法

1.1標本來源 選取2015年1月至2017年12月沈陽醫學院附屬中心醫院病理科79例乳腺浸潤性導管癌標本為實驗組，20例相應距腫瘤組織5 cm以上的癌旁正常乳腺組織標本為對照組，所有患者臨床病理資料存檔完整。患者年齡30～78歲，中位年齡58歲；腫瘤直徑<2 cm 16例，≥2 cm 63例；組織學分級Ⅰ級2例，Ⅱ級54例，Ⅲ級23例；有淋巴結轉移33例，無淋巴結轉移46例。患者行免疫組織化學檢測時均未行放化療。

1.2主要試劑 通用型p62鼠抗人單克隆抗體購自美國Abcam 公司；Ki-67即用型鼠抗人單克隆抗體、鏈霉菌抗生素-過氧化物酶連接法(SP)試劑盒及二氨基聯苯胺(DAB)均購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.3SP法免疫組織化學染色 乳腺浸潤性導管癌患者腫物切除后均使用10%中性甲醛固定，依據病理規定規范取材，石蠟包埋，4 μm連續切片，常規石蠟脫水，檸檬酸抗原修復(pH6.0)、高壓修復，室溫冷卻30 min；用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)沖洗3次，每次3 min，用油筆圈定玻片上的待測組織區域；每張切片滴加過氧化酶阻斷試劑3%H2O2(試劑A)，室溫下孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗3次，每次3 min；每張切片滴加非免疫動物血清(試劑B)，室溫下孵育10 min；除去血清，每張切片滴加第一抗體p62(稀釋比1∶200)或Ki-67 4℃冰箱冷藏過夜；PBS沖洗3次，每次3 min，每張切片加生物素標記的第二抗體(試劑C)室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min；每張切片滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液(試劑D)，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min；每張切片滴加新鮮配制的DAB，顯微鏡下觀察3～10 min。自來水沖洗，蘇木素復染，PBS或自來水沖洗返藍，切片經梯度酒精脫水，二甲苯透明后，中性樹膠封固。使用PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性乳腺癌標本切片作陽性對照。

1.4結果判讀 免疫組化切片均由兩位經驗豐富的病理科醫師采用雙盲法單獨判讀。(1)p62 陽性結果判讀標準：p62陽性表達為出現棕黃色顆粒，并定位于細胞質。(2)Ki-67陽性判斷標準：陽性表達定位于細胞核。在高倍鏡下任意計數5個視野，每次選取200個細胞進行觀察，按陽性細胞所占百分比計分，評分標準〔5〕:0分為無陽性細胞；1分為陽性細胞<10%；2分為陽性細胞10%～30%；3分為陽性細胞>30%。按染色強度計分：不著色為0分；淡黃色計1分；黃色計2分；棕黃色計3分。陽性細胞百分比計分與染色強度計分的乘積:0～2分為陰性，3～9分為陽性。

1.5統計學處理 應用SPSS17.0軟件行χ2檢驗，關聯性分析采用Spearman 等級相關分析。

2 結 果

2.1p62和Ki-67在乳腺組織中表達 實驗組p62陽性表達率為58.2%(46/79)，明顯高于對照組10.0%(2/20；χ2=6.532,P=0.011)；Ki-67陽性表達率為51.9%(41/79)，明顯高于對照組5.0%(1/20；χ2=7.389,P=0.007)。見圖1。

2.2p62和Ki-67表達與臨床病理特征的關系 實驗組中，p62和Ki-67陽性率均與組織學分級相關，且組織學分級越高，兩者陽性率越高；p62陽性率與淋巴結轉移相關。見表1。

p62陽性

p62陰性

Ki-67 陽性

Ki-67陰性

臨床病理特征n p62+ -χ2值P值Ki-67+-χ2值P值年齡(歲) ≤605131 200.3870.53430212.7640.096 >602815 131117淋巴結轉移 是332679.8470.00217160.0030.954 否4620262422腫瘤直徑 <2 cm16791.7290.189970.1520.696 ≥2 cm633924 3231組織學分級 Ⅰ、Ⅱ級5628285.3540.021193724.882 0.000 Ⅲ級23185 221

2.3p62和Ki-67相關性分析 p62和Ki-67共同陽性表達30例，共同陰性表達22例；p62陰性表達而Ki-67陽性表達11例；p62陽性表達而Ki-67陰性表達16例。p62和ki-67表達呈正相關(r=0.315,P=0.005)。

3 討 論

乳腺浸潤性導管癌是乳腺癌中最常見且惡性程度較高的一種病理類型，發病率呈逐年上升趨勢。自噬是細胞在生理狀態下適應環境的一種保護機制，自噬異常參與了腫瘤的發生、發展等病理過程〔6〕。自噬相關蛋白p62是一種支架蛋白。自噬發生時，p62首先與細胞質中泛素化蛋白結合，再與定位于自噬體內膜上的微管相關蛋白輕鏈3(LC3B)形成復合物，被自噬溶酶體降解；自噬過程中，p62蛋白在細胞質中不斷被降解，自噬被抑制時，p62蛋白在細胞質中不斷積累，因此p62可作為反映自噬活性的標記蛋白。雷程等〔7〕研究表明，p62蛋白在結腸癌組織細胞質中陽性表達明顯高于癌旁正常組織，p62高表達提示自噬活動減弱，促進腫瘤發展；劉婷婷等〔8〕研究發現p62在外陰鱗狀細胞癌的細胞質中表達明顯高于外陰的正常皮膚，說明外陰鱗狀細胞癌自噬活動減弱促進了癌的發生，與本實驗結果一致。p62異常聚集表明乳腺浸潤性導管癌自噬活性顯著減弱，自身受損、變性或衰老細胞器和大分子物質得不到及時降解，導致活性氧大量產生，使乳腺正常組織DNA損傷，促使正常乳腺組織向乳腺浸潤性導管癌進一步轉化。

以往研究提示細胞內p62異常聚集能激活雷帕霉素靶蛋白(mTOR)癌基因信號，反向調節自噬，起到促癌作用〔9〕；近年來發現細胞內p62異常聚集還可以激活核因子(NF)-κB和核因子相關因子(Nrf)2兩個系統〔10〕。p62蛋白通過T6BD與腫瘤壞死因子受體相關因子(TRAF)6相互作用促進TRAF6寡聚化，從而導致TRAF6多聚泛素化及NF-κB〔11〕活化。NF-κB是一個轉錄因子蛋白家族，涉及細胞存活及分化，NF-κB信號途徑激活對于腫瘤細胞增殖及轉移非常重要；Nrf2是細胞內最重要的抗氧化應激調控通路因子，可穩定細胞內環境〔12〕。當氧化應激持續存在時，p62與Nrf2競爭結合腫瘤抑制因子(Keap)1，使Nrf2入核，從而激活Nrf2靶基因轉錄，保護腫瘤細胞免受氧化性損傷，使癌細胞生存能力增強。本實驗結果顯示，p62表達與腫瘤的惡性行為相關，其高表達預示惡性程度高，易發生轉移，是預后差的指標。Burdelski等〔13〕使用免疫組化技術檢測了前列腺癌組織中p62的表達，發現其表達與組織學分級及淋巴結轉移有關，其結果與本實驗相似。Ki-67是一種與細胞增殖密切相關的核抗原，是評價惡性腫瘤細胞增殖程度最可靠的指標。在乳腺浸潤性導管癌組織中Ki-67的高表達可提示腫瘤細胞增殖活躍，侵襲力強，易發生轉移，預后較差。乳腺浸潤性導管癌組織中p62和Ki-67表達呈顯著正相關,表明兩者共同促進腫瘤發生；且兩者高表達預示腫瘤惡性程度高、侵襲力強，易發生轉移；有希望成為判斷乳腺浸潤性導管癌預后的有力指標。