Diversin在結直腸癌中表達及與臨床病理因素的關系

廖鑫 曾憲東 林建飛 李楠洋 王翠芳 吳非 白陽 程新宇 欒嵐

(沈陽醫學院 1基礎醫學院研究生院，遼寧 沈陽 110034；2附屬中心醫院病理科)

在西方國家，結直腸癌是癌癥死亡的第2大原因，最新的全球癌癥統計數據顯示，在亞洲地區結直腸癌的發生呈上升態勢〔1～3〕。在中國，結直腸癌是癌癥死亡的第5大原因，在經濟較發達的城市比例更高〔4〕。目前，結直腸癌的治療手段包括手術、化療、放療，其中以手術治療為主，但仍有20%～30%的患者出現病情復發。Diversin是果蠅屬Diego蛋白在哺乳動物中的同系物〔5，6〕。研究發現在新生小鼠和成鼠腦內，Diversin表達于室下區和海馬區的神經母細胞和成熟神經元，并證實Diversin可促進其增殖活性〔7〕。近年來課題組發現Diversin在非小細胞肺癌中高表達，對腫瘤的發生發展起促進作用〔8〕。目前尚未見Diversin 在結直腸癌組織中表達的報道。本研究檢測結直腸癌及癌旁組織中Diversin 的表達及與臨床病理參數的關系。

1 材料與方法

1.1臨床資料 收集沈陽醫學院附屬中心醫院病理科2010～2011年經手術切除病理證實為結直腸癌的蠟塊標本51例(結直腸癌組)，男35例，女16例，年齡33～87歲。結腸癌28例，直腸癌23例，高分化病人36例 ，中低分化病人15例，分期標準參照國際抗癌聯盟(UICC)的 TNM 標準，Ⅰ～Ⅱ期31例，Ⅲ～Ⅳ期20例，淋巴結轉移24例，所有患者術前未接受新輔助治療。本研究經沈陽醫學院當地機構審查委員會批準。同時收集了來自相同患者的51例相鄰組織標本作為陰性對照組。

1.2主要試劑 鼠抗人Diversin 抗體(1∶400)購自美國 Santa Cruz 公司；二抗〔快捷型酶標羊抗鼠/兔免疫球蛋白(Ig)G聚合物〕，粉劑型磷酸鹽緩沖液(PBS)，二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒，粉劑型抗原修復液均購于福州邁新生物技術開發有限公司。

1.3EnVision兩步法進行免疫組織化學染色 10%的甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片厚度4 μm，應用蘇木精-伊紅染色，行病理診斷。用80℃烤箱對切片進行烘烤1 h，再用乙醇脫水，應用枸櫞酸緩沖液行高溫高壓水化修復過程，之后 PBS 洗3次，并使內源性過氧化物酶滅活，加入一抗(1∶400)50 μl，溫度控制于4℃一夜;再用PBS洗3次，加入二抗50 μl。室溫下 DAB顯色，PBS 洗3次，蘇木精輕度復染，鹽酸乙醇分化后流動清水沖洗 10 min，梯度乙醇脫水，松節油透明和樹膠行封片處理，PBS 代替一抗作為陰性對照，光鏡下觀察。

1.4結果判讀 Diversin 主要表達于細胞膜和細胞質中，陽性表達為棕黃色，由2名病理醫師進行盲法評估，隨機選取5個100倍視野通過評估染色強度和每個載玻片代表性區域染色的細胞百分比，對所有載玻片進行半定量評分。染色的細胞百分比評分為0(≤4%)、1(5%～24%)、2(25%～49%)、3(50%～74%)和4(≥75%)分。根據染色強度，Diversin的表達分為4個等級：0(無染色)、1(淡黃色顆粒)、2(黃色)、3(深黃色顆粒)級。將染色強度的分數和每個腫瘤樣品中染色的陽性細胞的百分比評分相乘，總分為0～12分。得分<3分認為是陰性，≥3分被定義為陽性。

1.5統計學方法 采用 SPSS22.0軟件行χ2檢驗。

2 結 果

2.1Diversin在結直腸癌組織中的表達 陰性對照組腸上皮細胞中檢測到Diversin陽性表達率為98.0%(5/51)，結直腸癌患者Diversin陽性表達率為80.39%(41/51)，陽性信號主要表達于腫瘤細胞的胞質和細胞膜中，見圖1。

2.2Diversin在結直腸癌組織中的表達與各臨床病理參數之間的關系 Diversin的陽性表達在不同分化程度、臨床分級和淋巴結轉移的結直腸癌患者中差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

圖1 Diversin在兩組中的表達(DAB，×100)

表1 Diversin在結直腸癌組織中的表達與臨床病理因素的關系(n)

3 討 論

小鼠Diversin是由712個氨基酸編碼的蛋白質，有3個功能域，分別是包含8個錨蛋白重復序列的氨基端、與酪蛋白激酶(CKI)ε相互作用的保守中心區(第287～544氨基酸)及連接Conductin或Axin的羧基端(第583～712氨基酸)〔9〕。目前已證實氨基端錨蛋白重復序列可與Dishevelled的普列克底物蛋白(DEP)區直接結合〔10〕。Luan等〔8〕研究發現Diversin在非小細胞肺癌(NSCLC)中過表達，NSCLC中過表達并預測其預后不良，Diversin可能通過c-Jun氨基末端激酶(JNK)途徑促進細胞增殖和侵襲；Yu 等〔11〕研究發現，在乳腺癌中存在Diversin過度表達，并與TNM分期和淋巴結轉移相關，結果表明，Diversin是乳腺癌進展的重要調節因子。初瑞等〔12〕發現Diversin 在胃腺癌中的表達與淋巴結轉移、浸潤深度、腫瘤大小均呈正相關，與年齡、性別和分化程度不相關。Diversin 在結直腸癌中的表達及作用機制尚未見報道。本文首次研究了Diversin在人類結直腸癌中的表達情況，發現Diversin蛋白在結直腸癌中存在高表達，并與結直腸癌的中～低分化、高分期和淋巴結轉移相關，在結直腸癌中發揮著促癌作用。