IL-23/IL-17炎癥軸與冠心病及動脈粥樣硬化的關系

黃珊 楊洋 孟慶雯 左琦

(海南醫學院第一附屬醫院心血管內科，海南 ?？?570102)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是指冠狀動脈發生動脈粥樣硬化(AS)而引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導致的心臟病，又稱為冠心病(CHD)〔1〕。AS斑塊主要由浸潤的炎癥細胞(如巨噬細胞，T細胞，樹突細胞等)介導形成，因此炎癥反應被認為是CHD及其他AS并發癥的重要機制〔2〕。白細胞介素(IL)-23/IL-17炎癥軸是介導炎癥級聯反應的重要信號軸，在AS與CHD的發生發展過程中起到重要調控作用〔3，4〕。其中，炎癥因子IL-23可促進Th17細胞的生存與分化，同時Th17細胞又可通過腫瘤壞死因子(TNF)炎癥通路、細胞核轉錄因子(NF)-κB通路等分泌IL-17，從而引起炎癥反應〔5〕。另外，IL-23可能通過影響巨噬細胞源性泡沫細胞促進AS的發生和發展〔6〕。但IL-23/IL-17調控CHD發展的具體作用機制還未見報道。本研究擬進一步探討IL-23/IL-17炎癥軸與CHD及AS之間的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1～11月在海南醫學院第一附屬醫院行冠狀動脈造影的患者56例，排除患有自身免疫性疾病、慢性感染性疾病、肝腎功能不全者。將36例診斷為冠心病的患者分別納入穩定性心絞痛組(18例)和不穩定性心絞痛(18例)，另外對照組20例。穩定性心絞痛組中男10例，女8例，年齡31～64〔平均(53±1.56)〕歲；不穩定性心絞痛組中男9例，女9例，年齡35～68〔平均(57 ± 2.38)〕歲；對照組中男11例，女9例，年齡37～64〔平均(55 ± 2.68)〕歲。3組一般資料無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究已得到倫理委員會批準，且均已簽署知情同意書。

1.2實驗試劑 人單核細胞系THP-1購自北京協和細胞資源中心。RPMI1640培養液和胎牛血清購自英國Abcam公司。佛波酯(PMA)購自北京百靈威生物科技有限公司。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)購自北京索萊寶科技有限公司。IL-17、IL-23、IL-1β、IL-6和TNF-α試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司。NF-κB P65、IL-1β、IL-6和TNF-α一抗和實驗所用二抗均購自英國Abcam公司。

1.3細胞培養 人單核細胞系THP-1用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養液在5% CO2的細胞培養箱中培養，溫度為37℃。每2 d換一次培養液，3～4 d傳代一次。細胞計數后參照文獻〔7〕方法，用含100 ng/ml PMA的培養液調整細胞濃度，以2.5×104個/ml的濃度接種于96孔板上。培養72 h后，THP-1經PMA誘導分化為巨噬細胞，隨機分為兩組，去除含PMA的原培養液，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2次，分別加入ox-LDL培養液，對照組加入0 mg/ml的ox-LDL，誘導組加入50 mg/ml的ox-LDL處理，培養24 h后觀測細胞形態并進行檢測。

1.4酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測炎癥因子的表達 采取受試者外周血5 ml，離心(3 500 r/min，15 min)后取血清，保存于-20℃待測。IL-17、IL-23、IL-1β、IL-6和TNF-α的濃度均使用ELISA試劑盒檢測，嚴格按照試劑盒說明書操作。

ox-LDL培養液培養24 h后，收集對照組與誘導組的細胞培養液，1 000 r/min離心5 min，收集上清液，根據ELISA試劑盒說明書檢測IL-23、IL-17的濃度。

1.5Western印跡檢測蛋白表達 ox-LDL培養液培養24 h后，吸取培養液用PBS洗滌2次，用RIPA裂解液進行裂解處理，置于冰上每10 min震蕩一次，共4次，用BCA法進行蛋白定量。蛋白調至相同濃度后加入5×蛋白上樣緩沖液，95℃變性5 min，以1 500 r/min低速離心后以待上樣。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶室溫封閉2 h，分別加入NF-κB P65一抗(兔抗人IgG)溶液(1∶1 000)、IL-1β一抗(兔抗人IgG)溶液(1∶500)、IL-6一抗(兔抗人IgG)溶液(1∶1 000)和IL-6一抗(兔抗人IgG)溶液(1∶500)于4℃孵育過夜。第二天用Tris-HCl緩沖鹽溶液加吐溫20(TBST)洗滌3次，每次5 min。加入二抗，室溫孵育2 h，TBST緩沖液洗滌5次，每次8 min。抗體封閉洗脫完畢后，對PVDF膜進行顯影。使用FCE型凝膠化學發光成像儀拍照，Image J軟件進行灰度分析。

1.6統計學方法 采用SPSS19.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1炎癥因子濃度在血清中的變化 穩定性心絞痛組和不穩定性心絞痛組血清中IL-23與IL-17濃度均明顯高于對照組，且不穩定性心絞痛組IL-23與IL-17濃度最高(P<0.01，P<0.001)。同時，與對照組比較，穩定性心絞痛組和不穩定性心絞痛組血清IL-1β、IL-6和TNF-α濃度均明顯升高(P<0.01，P<0.001)，且不穩定性心絞痛組IL-1β、IL-6、TNF-α濃度高于穩定性心絞痛組(P<0.05)。見表1，表2。

2.2IL-17和IL-23在泡沫細胞中的表達 對照組細胞為THP-1細胞分化的巨噬細胞，呈圓形或橢圓形貼壁生長；誘導組細胞，經油紅O染色，顯微鏡下可見細胞質內有大量紅色脂質顆粒沉積，符合泡沫細胞的形態學特征，見圖1。與對照組相比，誘導組中IL-17與IL-23濃度顯著升高(P<0.01，表3)。

表1 3組血清IL-17和IL-23濃度比較

與對照組比較：1)P<0.01，2)P<0.001

表2 3組血清IL-1β、IL-6和TNF-α濃度比較

與對照組比較：1)P<0.01,2)P<0.001；與穩定性心絞痛組比較：3)P<0.05，下表同

圖1 ox-LDL誘導的THP-1細胞形態變化(油紅O染色，×200)

組別IL-17IL-23對照組412.0±54.2345±41.3誘導組734±67.11)687±87.51)

2.3NF-κB P65、IL-1β、IL-6和TNF-α在泡沫細胞中的表達 誘導組THP-1細胞NF-κB P65、IL-1β、IL-6和TNF-α表達均明顯高于對照組(P<0.01，圖2，表4)，表明NF-κB P65信號通路參與了CHD患者炎癥反應的調控。

圖2 Western印跡檢測細胞中NF-κB P65、IL-1β、IL-6和TNF-α的表達

組別NF-κB P65 IL-1βIL-6TNF-α對照組0.12±0.040.10±0.020.20±0.020.11±0.05誘導組0.84±0.061)0.92±0.071)0.95±0.081)0.89±0.071)

3 討 論

CHD是一種AS引起的慢性炎癥性疾病，其發病機制與動脈脂代謝紊亂、遺傳因素和免疫反應異常有關，發病過程中巨噬細胞可分化形成泡沫細胞，從而分泌出大量炎癥介質誘導炎癥反應的發生〔8～10〕。大量研究表明，炎癥系統異常與CHD患者預后密切相關，是導致CHD患者心絞痛不穩定的主要因素〔11〕。IL-23/IL-17炎癥軸在CHD等炎癥性疾病的發病過程中起關鍵作用，可通過激活巨噬細胞進而誘導中性粒細胞聚集加重病情并產生不良預后〔12〕。因此，探究IL-23/IL-17在CHD中的作用及作用機制可能有利于尋找CHD治療的潛力藥物。本實驗結果表明，IL-23/IL-17炎癥軸的激活引起了相應炎癥因子濃度升高，并可能導致CHD患者不穩定性心絞痛。

巨噬細胞是血管炎癥的中心載體，在AS的發病機制中扮演重要角色〔13〕。細胞ox-LDL水平與CHD患者體內M1巨噬細胞的分化有直接關系，ox-LDL可誘導巨噬細胞分化為泡沫細胞，從而誘導炎癥因子的產生，誘發AS〔14〕。本實驗用PMA誘導THP-1細胞系分化后與ox-LDL共同孵育，誘導泡沫細胞形成，經形態學觀察表明細胞模型構建成功。進一步研究發現，泡沫細胞IL-23和IL-17的濃度與正常巨噬細胞比較明顯升高，同時，泡沫細胞中NF-κB P65、IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白呈高表達狀態，進一步表明IL-23/IL-17炎癥軸參與了CHD及AS的發生發展。

研究表明，NF-κB 信號通路的激活是冠狀動脈微栓塞炎癥反應的主要發病機制〔15〕。通過上游因子的活化可促使NF-κB激活，進一步促進TNF-α及其他促炎因子的釋放，最終影響冠狀動脈微栓塞引發的心臟功能障礙的發生和發展〔16〕。IL-23在脂多糖(LPS)的刺激或異常的炎癥條件下，可使NF-κB信號通路激活，刺激CD4+T細胞分化為Th17，使Th17分泌促炎癥因子IL-1、IL-6、IL-17、IL-22和TNF-α，表明NF-κB信號通路參與IL-23/IL-17炎癥軸的活化，進一步引起炎癥反應〔17,18〕。同時，NF-κB信號通路與IL-23/IL-17炎癥軸的共同作用使IL-1β與TNF-α在巨噬泡沫細胞中聚集并發生炎癥反應，提示二者共同作用參與了CHD及相關疾病的病程發展〔19〕。本文研究結果提示IL-23/IL-17炎癥軸誘導CHD患者炎癥反應可能與激活NF-κB炎癥信號通路有關。

綜上所述，IL-23/IL-17炎癥軸的活化與CHD患者的炎癥反應密切相關，可能是導致不穩定性心絞痛的原因，并且作用機制可能與NF-κB信號通路的激活有關。