白介素-1β在大鼠皮膚創傷后不同時段的表達

李翼彬，李俊岑，趙鑫鑫，金 昊

(1.成都市第三人民醫院，四川 成都，610000；2.成都醫學院實驗技術教研室，四川 成都，610081)

創傷愈合是一個復雜的病理生理過程，主要包括炎癥反應期、增殖期和瘢痕修復期[1]。但創傷修復的機制目前仍未完全明了。白介素-1β( IL-1β)作為創傷修復過程中較重要的細胞因子，具有促進成纖維細胞、血管內皮細胞增殖和細胞外基質沉積等作用［2-3］。但是，在皮膚創傷后不同時段不同組織部位中，IL-1β的表達變化仍不清楚。因此，本文通過建立大鼠皮膚創傷修復模型，從形態學上觀察創傷后不同時段創傷皮膚組織病理變化以及IL-1β的表達變化，為進一步探討IL-1β在創傷修復過程中的潛在機制提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 動 物

SD 品系大鼠15只， 由成都醫學院實驗動物中心提供，隨機分為1d、3d、7d三個時間段組，每組5只。

1.2 模型制備

各組大鼠實驗前1d脫毛，稱重。用3.6%水合氯醛腹腔注射麻醉(用量1 ml/kg體重) ，固定于手術臺上，常規消毒。在距脊柱0.5cm處，用刀將1.5cm×1.5cm范圍內的皮膚切除， 不傷及脊柱旁肌肉上的脂肪及筋膜， 術后每日給予標準飼料喂養，動物飼養室溫維持在25～30℃。

1.3 免疫組織化學染色

各組大鼠用3.6%水合氯醛（1 ml/kg）腹腔麻醉后，切取距損傷邊緣10mm的皮膚全層組織，浸泡于4%多聚甲醛溶液24-36h，石蠟包埋，沿皮膚縱切面切片，制作5μm厚的石蠟切片每組取5張石蠟切片，具體染色步驟按IL-1β免疫組化SP試劑盒說明執行。DAB顯色，蘇木素復染，二甲苯透明，樹膠封片。用PBS代IL-1β抗體做陰性對照組，其余步驟不變。

1.4 結果觀察

采用OLYMPUS數碼照像機采集圖像，觀察IL-1β陽性產物在皮膚組織中的分布，用 Image-Pro Plus 6.0 圖像處理軟件測量未愈合面積，以及陽性反應物的平均光密度值（MD）。

1.5 統計學處理

各組未愈合面積和平均光密度值數據以均數±標準差表示，用SPSS 20.0 軟件包，組間比較采用方差分析 LSD 法。

2 結 果

2.1 創傷未愈面積結果

損傷后1d、3d、7d大鼠創傷皮膚未愈合面積均逐漸縮小，各組未愈合面積均存在統計學差異（P＜0.05）如圖1，表1）。

2.2 HE染色結果

損傷后1d，鏡下組織間隙散布著大量紅細胞，也可見擴張充血的毛細血管，小血管內可見血栓形成。損傷周圍可見少量中性粒細胞等炎性細胞浸潤（圖2-a）。損傷后3d，肉芽組織大量形成，向創口延伸。損傷區周圍可見毛細血管生成，中性粒細胞和巨噬細胞大量浸潤，大量成纖維細胞存在（圖2-b）。損傷后7d，肉芽組織已基本填平創口，成纖維細胞向纖維細胞轉化。肉芽組織向瘢痕組織轉變。損傷區周圍可見大量的梭形細胞核的纖維細胞，炎性細胞少見（圖2-c）。

2.3 免疫組化染色結果

2.3.1 損傷邊緣 皮膚內IL-1β免疫陽性反應物的分布概況 光鏡下觀察到IL-1β在動物上皮組織、巨噬細胞、成纖維細胞中有表達，陽性反應物主要定位在胞核、胞漿和基質中。

圖1 創傷皮膚未愈合面積：a，b，c分別示大鼠皮膚創傷后1d，3d，7d 未愈合皮膚面積

圖2 創傷皮膚組織HE染色：a 損傷后1d，鏡下組織間隙散布大量紅細胞，可見擴張充血的毛細血管，血管內可見血栓形成。損傷周圍可見少量中性粒細胞等炎性細胞浸潤 (HE×400)；b 損傷后3d，肉芽組織大量形成，向創口延伸。損傷區周圍可見毛細血管生成，中性粒細胞和巨噬細胞大量浸潤，大量成纖維細胞存在。(HE×400)；c 損傷后7d，肉芽組織已基本填平創口，成纖維細胞向纖維細胞轉化。肉芽組織向瘢痕組織轉變。損傷區周圍可見大量細胞核呈梭形的纖維細胞，炎性細胞少見(HE×400)。

圖3 創傷皮膚組織免疫組織化學染色：a 損傷后1d，皮膚表皮細胞、擴張的血管內皮細胞、成纖維細胞、浸潤的中性粒細胞中的胞漿中內可見少許IL-1β免疫反應陽性物，呈弱染色(IHC×400)；b 損傷后3d，IL-1β在表皮細胞、成纖維細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、的胞漿表達增強，呈強染色(IHC×400)；c 損傷后7d，表皮細胞、成纖維細胞的胞漿內IL-1β免疫反應陽性物減弱，呈弱染色(IHC×400)

2.3.2 皮膚創傷后IL-1β的變化 損傷后1d，皮膚表皮細胞、擴張的血管內皮細胞、成纖維細胞、浸潤的中性粒細胞中的胞漿中可見IL-1β免疫反應陽性物(圖3-a)。損傷后3d，損傷區大量炎癥細胞浸潤，成纖維細胞增殖，IL-1β在表皮細胞、成纖維細胞、巨噬細胞、中性粒細胞的胞漿表達增強，表達強度明顯高于損傷后1d組(P＜0.05)(圖3-b)。損傷后7d，表皮細胞、成纖維細胞的胞漿內IL-1β免疫反應陽性物減弱，較損傷后3d有明顯差異(P ＜ 0.05)(圖 3-c)。

免疫組織化學方法對照實驗結果均為陰性。

表1 不同時間段未愈合面積和IL-1β免疫反應陽性物平均光密度值 （±s）

表1 不同時間段未愈合面積和IL-1β免疫反應陽性物平均光密度值 （±s）

備注：▲大鼠皮膚創傷后1d、7d與3d比較，P＜0.05

損傷時間 平均光密度值 未愈合面積（mm2）1d 1.19±0.047▲ 146.36±0.488▲3d 1.47±0.828 143.57±1.157 7d 1.20±0.053▲ 29.13±1.065▲

3 討 論

3.1 大鼠皮膚創傷修復面積和組織病理變化

本實驗結果示：大鼠皮膚創傷后1d、3d、7d的創傷皮膚未愈面積逐漸縮小，1d、7d組與3d組存在統計學差異（P＜0.05）。損傷后1d，鏡下可見真皮層毛細血管擴張充血，血栓形成，炎性細胞浸潤損傷周圍，表明皮膚損傷后1d處于損傷修復的止血和炎癥反應階段。相關研究顯示：在皮膚創傷后的止血和炎癥反應階段，毛細血管收縮、血小板聚集、纖維蛋白凝塊形成、多種修復細胞、生長因子以及細胞外基質參與此過程[4-6]。損傷后3d，肉芽組織大量形成并向創口生長，損傷區周圍可見大量成纖維細胞、巨噬細胞及新生毛細血管，此期進入細胞增殖和分化階段。Demidova-Rice TN等[7]認為：在此階段，血管開始形成，炎癥細胞及上皮細胞、真皮細胞分泌生長因子，誘導細胞增殖，啟動細胞遷移。創口內大量成纖維細胞增生，合成細胞外基質，形成富含新生血管的肉芽組織。細胞增殖分化是動態進行的，細胞和細胞外基質通過生物因子介導而相互作用。損傷后7d，肉芽組織已基本填平創口，成纖維細胞大量分泌膠原蛋白；肉芽組織逐漸纖維化并向瘢痕組織轉變。在損傷區周圍可見大量梭形細胞核的纖維細胞，炎性細胞少見此時期進入組織重建或瘢痕形成階段。Honnegowda TM等[8]認為肉芽組織被重塑過程中，富含膠原蛋白Ⅰ的細胞外基質將會逐漸取代膠原蛋白Ⅲ、纖維蛋白、纖連蛋白、透明質酸等。膠纖維母細胞及肌成纖維細胞逐漸向損傷區遷移，參與肉芽組織基質重建。最后，成纖維細胞凋亡，形成相對無細胞、其抗張強度和正常皮膚組織相仿的瘢痕組織。

3.2 大鼠皮膚創傷后IL-1β的表達變化

白介素1（IL-1）是一種免疫調節因子，參與了固有免疫細胞和淋巴細胞的分化，在自發性炎癥、自身免疫和感染性疾病中發揮主要作用。IL-1炎癥因子家族和IL-1受體成員（IL-1α、IL-1β、IL-1受體拮抗劑、IL-18，IL-33 、IL-36、IL-37、IL-38）在炎癥反應中通過IL-1受體發揮各自獨特的作用[9-10]。本實驗通過免疫組化染色對損傷邊緣皮膚中的IL-1β免疫陽性反應物進行觀察，并對IL-1β陽性反應物進行了光密度檢測，對其表達水平行半定量分析。結果發現IL-1β在動物上皮組織、巨噬細胞、成纖維細胞中有表達，陽性反應物主要定位在胞核、胞漿和基質中。這表明了當機體受到創傷等嚴重打擊后，體內會相續啟動一系列復雜的細胞生物學效應，包括應激信號的激活和傳遞、炎癥反應失衡、各種有害因素的釋放。

本實驗中，大鼠皮膚創傷后1d至3d，IL-1表達逐漸增強，在3d達到高峰，3d后隨著時間的推移，表達逐漸減弱。同時，實驗數據分析表明，在損傷后1d至3d，大鼠的創傷面積愈合率為2%，3d至7d的創傷面積愈合率為79%，遠遠大于大鼠皮膚損傷后前3天的愈合率。筆者認為大鼠皮膚愈合速度可能會隨著炎癥因子IL-1β的表達逐漸減弱，而逐漸增快。這可能與IL-1β激活的幾條重要的信號轉導途徑相關，例如：IL-1受體相關激酶途徑、磷脂酰肌醇3激酶信號轉導途徑、JAK STAT信號通路和離子通道[11]。樂海浪等[12]認為：創傷后炎癥反應在創傷的病理過程中發揮了重要的作用，可能誘發部分創傷并發癥，例如：膿毒癥、多器官衰竭、高代謝、深靜脈血栓形成等。TNFα、IL-1、IL-6、C-反應蛋白等均是創傷后炎癥反應的敏感指標，能反應創傷患者的病情，評價炎癥反應的嚴重程度。陳先玖等[13]采用舒筋活血湯治療慢性創傷性膝關節滑膜炎患者，結果顯著降低了TNF-α、IL-1β水平，改善了關節疼痛癥狀，提高了治療總有效率。朱曉燕等[14]采用香連金黃散下調感染皮膚局部的炎癥因子IL-1β等表達，使實驗組皮膚恢復效果優于對照組。李鳳蕾等[15]認為采用高劑量烏靈菌粉可改善PTSD大鼠焦慮樣行為，這種作用可能與其降低海馬組織中IL-1β、IL-6的水平有關。因此，臨床中可通過早期監測這些重要炎癥指標，采取適當的措施阻止炎癥反應的進一步發展，以有效降低MODS發生率，減少創傷患者死亡率，促進創口愈合，縮短愈合周期。

但是，損傷修復的作用機制并不是通過單一因子的調節，而是一個復雜的分子網絡。炎癥相關酶、炎癥介質、細胞因子、黏附因子等在炎癥過程中都發揮著重要作用，特別是 IL-1和TNF-α等，對炎癥反應起重要調節作用[16]。抑制促炎因子是否能促進傷口的愈合，仍值得進一步深入探索。