Nanofat制作、臨床應用及作用機制的研究進展

曾茂嬌 （綜述），賀光照（審校）

（重慶醫科大學附屬第一醫院整形燒傷科，重慶，400016）

自Coleman等學者對脂肪移植技術進行標準化以來，顆粒脂肪移植已成為整形外科中非常重要的材料，廣泛應用于全身各部位軟組織缺失的修復、皮膚老化的改善及慢性創面的治療等，療效肯定[1]。顆粒脂肪分為大顆粒脂肪（macrofat）和小顆粒脂肪（microfat）[2]。Macrofat多用于改善因先天性、外傷、疾病或老化引起的局部軟組織缺損，一般采用直徑2mm的鈍針進行注射，適用于乳房和臀部等大范圍部位的填充[3]。隨著面部自體脂肪填充的發展，臨床上逐漸開始使用0.7mm直徑的注脂針來注射更細的顆粒脂肪，這種直徑的脂肪組織被稱為Microfat[2]。顆粒脂肪移植在容積改善方面作用較大，然而，對于面部細小溝槽、皺紋、眼瞼、口周、頸紋、瘢痕組織等精細區域的填充，顆粒脂肪難以順利通過細小注射針，必須使用更微小的脂肪組織進行注射[4]。

Tonnard等于2013年報道通過機械乳化的過程生產脂質乳液，稱之為“nanofat”[5]，直譯為“納米脂肪”。應當注意，nanofat并非等同于納米技術，Friji認為nanofat一詞有待商榷，因為細胞的大小是微米級別，乳化過濾后的脂肪難以達到納米級別，并建議將nanofat改為supermicrofat[6]，但目前nanofat一詞仍被廣泛使用，已成為約定俗成的名稱。大量研究表明nanofat中含有豐富的脂肪組織來源的SVF細胞與ADSCs，可以通過旁分泌作用或直接分化成脂肪細胞來提高脂肪移植物的存活率，對組織修復和再生具有重要作用，一經報道就被應用于改善皮膚老化狀態、抑制瘢痕增生及促進創面愈合等治療過程，收到了滿意的臨床效果[5，7，8]。現對nanofat的制作方法、臨床應用進展及其作用機制做一綜述。

1 Nanofat的制作方法

1.1 經典Tonnard法[5]

該法由Tonnard提出，具體操作步驟為：使用標準的脂肪抽吸裝置進行負壓吸脂術，吸脂部位選取為下腹部，吸脂管選擇為具有多口的直徑為3mm的套管，該套管具有直徑為1mm的尖銳側孔。獲取的脂肪以生理鹽水漂洗，并通過具有0.5mm孔徑的無菌尼龍布過濾，過濾后脂肪組織留取進行機械乳化。脂肪的乳化是通過使用Luer-Lok連接器連接兩個10mL注射器，借助注射器的對推使脂肪在注射器間來回轉移實現的。經過30次轉移后，脂肪變成乳液，并呈現出乳白色的外觀。乳化結束后再次用無菌尼龍布過濾脂肪液以去除可能阻塞細針的結締組織，將流出物收集在無菌接收器中，該流出物即為“nanofat”。

1.2 各種改良技術

在Tonnard法基礎上，不同學者對其進行了相應的改良。Liang等[9]和Wei等[10]通過使用20mL的注射器來實現脂肪的乳化，Wei等通過3min的對推過程獲取乳糜脂肪組織[10]，李聰等則進行90次的對推過程獲取乳糜脂肪組織[11]。Gu 等[12]和Kemaloglu[13]在得到乳糜化脂肪后用離心機以3000 r/min的速度離心3 min，取中層組織進行相關研究，并稱之為“濃縮nanofat”。Bi等對Tonnard法進行了更大的改進，采用0.2 mg/ml膠原酶I消化新鮮脂肪組織15min后再以330×g離心7min，收集上清液脂肪細胞部分并通過細胞濾網過濾，收集流出物稱之為“Vivo nanofat”，其研究顯示Vivo nanofat體內移植后的吸收率明顯低于nanofat[14]。Lo Furno等在得到乳糜化的脂肪后，未將脂肪乳液再次擠壓通過紗布過濾，將此乳糜化的脂肪定義為“nanofat 2.0”，并發現nanofat 2.0中ADSCs的密度高于普通的nanofat[15]。Jan 等也通過類似的方式獲取nanofat，稱之為“未過濾的nanofat”[16]。

2 Nanofat的臨床應用

2.1 面頸部年輕化

通過使用新分離的nanofat進行移植，或與自體顆粒脂肪相結合的共同移植是改善皮膚老化狀態和恢復皮膚活力的有效途徑，尤其適用于面部細小溝槽、黑眼圈、皺紋及頸紋等面頸部精細部位的局部注射治療。李聰等應用nanofat于48例患者眶周凹陷、細紋及暗沉處進行真皮及皮下層內注射，絕大多數患者于1次注射填充后即達到明顯改善，滿意度高[11]。Tonnard等將nanofat移植用于口周皺紋（38例），眉間凹陷皮膚（15例），曬傷皮膚（8例），疤痕（4例）和黑眼圈（2例）的治療，取得良好的臨床結果，患者皮膚質量有顯著改善，未觀察到如感染、脂肪囊腫等嚴重的并發癥[5]。Liang等研究發現103名接受nanofat和富血小板纖維蛋白（PRF）聯合注射的患者較128名注射透明質酸的患者，面部皮膚紋理得到更大程度的改善，滿意度更高[9]。Wei等采用nanofat、PRF和自體顆粒脂肪共同移植治療62名軟組織缺陷或皮膚衰老的患者，其臨床療效大于單純的脂肪移植組，總體滿意率高于90%[10]。Bi等為一名頸紋突出的患者進行局部注射nanofat，隨訪6個月，該患者頸紋得到顯著改善[14]。

2.2 瘢痕的治療

近來研究發現通過局部注射nanofat治療各類型的瘢痕可收到滿意的臨床效果。焦虎等將nanofat注射至33例凹陷性瘢痕組織內， 3月后可見瘢痕凹陷明顯變淺，顏色變淡、彈性更好、質地更柔軟[17]。Gu等使用“濃縮nanofat”結合小顆粒脂肪聯合移植治療25例萎縮性面部疤痕，患者術后在疤痕顏色、硬度、色素沉著、厚度等方面均有明顯改善，術后還觀察到基底細胞層中黑色素染色的增強以及發現新生的皮脂腺和汗腺[12]。Bhooshan等將nanofat注射到34例不同病因的瘢痕組織中，術后3個月可明顯緩解疼痛、瘙癢、僵硬度、厚度、顏色、不規則度等癥狀表現，還可改善血管分布、緩解程度、柔韌性、厚度和色素沉著等瘢痕特征[18]。Jan等將“未過濾的nanofat”注射到48例燒傷后面部瘢痕的皮下或皮內層面，隨訪6個月，發現瘢痕組織在色素沉著和柔韌性兩方面均具有顯著性的改善[16]。

2.3 其他治療

Nanofat可促進創面愈合和皮片成活：在1例左前壁具有創傷性皮膚缺損的病例中，Kemaloglu先對創面進行自體中厚皮片移植，隨后將nanofat注射入移植皮片下方，隨訪6個月，皮膚移植物存活良好且具有優異的柔韌性，創面的血管分布也令人滿意[13]。有學者將nanofat用于治療外陰硬化性苔蘚，2次注射后患者外陰形態明顯改善，皮膚黏膜質地及彈性明顯好轉，瘙癢、灼燒感消失，性生活質量明顯提高[19]。通過關節內注射Nanofat還可用于顳下頜關節病的治療，能有效的改善患者的疼痛、開口度、關節彈響等表現[20]。此外，相較于顆粒脂肪，nanofat移植更易注射于需要高精度注射的頭皮區域，該技術可用作毛囊移植的補充物或作為脫發的再生治療[21]。

3 Nanofat作用機制的探討

3.1 Nanofat含有大量SVF及ADSCs

Nanofat是一種源自脂肪組織的天然乳化懸浮液，研究顯示乳化過程使成熟的脂肪細胞完全被破壞，但未對干細胞的產量、活力、或成脂分化能力等產生顯著性的影響[8]。因此nanofat內雖不含有成熟脂肪細胞，但卻富含大量SVF，SVF中含有不同類型的細胞，如內皮細胞，單核細胞，粒細胞和巨噬細胞，還包括大量間充質干細胞（MSCs）[5，22]。Tonnard 等 報 道 nanofat 中 SVF 的 數 量 為1.98×106個/ 100mL nanofat，SVF中CD34細胞數量為0.1×106個/100mL nanofat[5]，具有CD34表型的細胞代表著具有巨大干細胞增殖能力的細胞群，在體外這類細胞具有多向分化潛能。Nanofat中ADSCs所占比例約為3.11%±0.8%，為標準脂肪抽吸物中的3倍[7]。ADSCs不僅具有多項分化功能，還具有旁分泌能力，可分泌血管內皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、肝細胞生長因子(HGF)等，進而調節新血管形成及組織再生，這些因子還具有抗氧化作用，可以抵抗在任何狀態下自由基形成的皮膚損傷[9，23]。此外，ADSCs能在真表皮細胞的影響下通過表型轉換分化為成纖維細胞及角質形成細胞直接參與真表皮的組織結構再生[24]。

3.2 Nanofat能促進脂肪移植物的存活

MSCs已被證明可提高脂肪移植物的活力，這主要是通過促進血管生成來實現的[7，22，24]。Yu 等將nanofat與顆粒脂肪移植物共同移植入裸鼠皮下，術后12周結果顯示，與對照組相比，共移植組表現出更高的移植物重量和體積保留，更好的組織結構和更高的毛細血管密度，這表明nanofat可以促進新生血管形成并改善脂肪移植物的存活[7]。另一方面，nanofat中含有大量的死亡的脂肪細胞，已知凋亡細胞釋放細胞因子并吸引誘導生長因子的巨噬細胞[25]，因此，共同注射乳化分解的脂肪細胞可能對ADSCs的分化和組織再生具有刺激作用。

3.3 Nanofat含有多種抗纖維化因子

Nanofat較顆粒脂肪組織富有更高濃度的ADSCs，ADSCs可以合成分泌多種抗纖維化因子，如白細胞介素-10（IL-10）、HGF等[26]。這些物質可參與皮膚黏膜創面的修復過程，抑制瘢痕生長的同時可改善皮膚質地，在面部年輕化、創傷修復中起到很好的治療效果[27，28]。在傷口愈合的增生期，ADSCs分泌的VEGF-A和bFGF可強而有效地促進血管內皮細胞遷移、增殖及分化，從而利于血管生成及穩定[29]。此外，脂肪細胞外基質中還含有抵抗素及腫瘤壞死因子（TNF）等物質，可誘導成纖維細胞的的凋亡，抑制其過度分泌致纖維物質；同時還能降低肥大細胞活性，使瘢痕增生得到一定程度的抑制[30]。近來研究還發現ADSCs能夠通過旁分泌作用抑制增生性瘢痕來源的成纖維細胞（HSF）內I、III型膠原，轉化生長因子-β1（TGF-β1），白細胞介素-6（IL-6），α-肌動蛋白（α-SMA），纖連蛋白（Fibronectin）及結締組織生長因子（CTGF）等促瘢痕增殖基因的表達，同時促進核心蛋白聚糖（Decorin）和基質金屬蛋白酶-1（MMP-1）等抗纖維化的基因的表達[31]。上述多種因素共同作用可有效改善皮膚質地，抑制瘢痕的增生。

3.4 其他抗纖維機制

Nanofat中的ADSCs除可通過分泌抗纖維化因子抑制瘢痕增生外，還可能存在其他抗纖維化的機制。研究表明，創面的炎癥環境可激發MSCs啟動免疫調節作用，上調前列腺素E2（PGE2）及環氧化酶-2（COX-2）的表達，以減輕炎癥反應并抑制炎癥反應延長導致的免疫功能紊亂[32]。ADSCs 還可促進T細胞產生誘導性NO，后者可改變ROS/RNS（反應活性氮類物質）平衡，阻止纖維化形成[33，34]。除此之外，ADSCs還能抑制HSF中TGF-β1及其細胞內信號通路相關分子（如p-smad2，p-smad3，p-Stat3和p-ERK）的蛋白質表達水平，從而實現抑制HSF的增殖、遷移和收縮等性能[31，35，36]。

4 臨床展望

由于缺乏完整的脂肪細胞，nanofat的體積效應顯然非常有限，與顆粒脂肪移植相比，nanofat移植的適應癥是截然不同的。Nanofat的發明實際上提供了一種簡單制備SVF及ADSCs的技術，更擴大了脂肪移植的治療范圍，為改善顆粒脂肪移植的存活率、瘢痕的治療及機體精細部位的局部注射提供了新思路，為整形和重建手術中的脂肪移植物的選擇及補充提供了一種潛在的臨床可行方法。